蛋白质含量测定法：原理、优缺点及常用方法总汇

蛋白质含量测定法：原理、优缺点及常用方法总汇

1 蛋白质含量测定方法

2

3. 免疫印迹

4 蛋白质沉淀法

5 蛋白质提取方法总结

1 蛋白质含量测定方法

本实验的目的是学习测定蛋白质含量的各种方法，了解各种测定方法的基本原理、优缺点。

蛋白质含量测定方法是生化研究中最常用、最基本的分析方法之一。常用的有四种古老的经典方法，即定氮法、双缩脲法（法）、福林-酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。此外，还有一种近十年才得到广泛应用的新测定方法，即考马斯亮蓝法（法）。其中以定氮法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比考马斯亮蓝法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但准确度较高，常以定氮法测定出的蛋白质作为其它方法的标准蛋白质。

值得注意的是，后四种方法并不适用于任何条件下任何形式的蛋白质，因为用这四种方法测量的蛋白质溶液可能产生四种不同的结果。每种测量方法都不是完美的，都有各自的优缺点。选择方法时，应考虑：①实验所需的灵敏度和准确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测量所需的时间。

考马斯亮蓝法（法）由于其突出的优点，得到越来越广泛的应用。

1.微量凯氏定氮法

将样品与浓硫酸一起加热，含氮有机物分解生成氨（消解），氨与硫酸反应生成硫酸铵，经强碱碱化后分解放出氨，以蒸汽形式蒸发到酸液中。根据酸液的中和程度，即可计算出样品的氮含量。以甘氨酸为例，反应式如下：

| + ® 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1)

氨

2NH3 + H2SO4®（NH4）2SO4（2）

(NH4)2SO4 + 2NaOH® 2H2O + + 2NH3 (3)

反应（1）和（2）在凯氏烧瓶中进行，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。

为了加快消解速度，可以加入CuSO4作为催化剂，加入K2SO4以提高溶液的沸点。可用硼酸溶液收集氨，用强酸滴定。这里不再赘述实验和计算方法。

计算的结果即为样品的总氮含量，如果要得到样品中的蛋白质含量，则要用总氮含量减去非蛋白质含量。

如果要进一步测定样品中的蛋白质含量，则将样品中的蛋白质氮乘以6.25。

五种蛋白质测定方法比较如下：

方法 灵敏度 时间 原理 干扰物质 描述 凯氏定氮法

（方法） 灵敏度低，适用于0.2~1.0mg氮气，误差为±2% 耗时

8-10小时将蛋白氮转化成氨，用酸吸收后再滴定非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离） 用于准确测定标准蛋白质含量；干扰少；太耗时 双缩脲法（法） 灵敏度低

1～20mg中速

20~30分钟多肽键+碱性Cu2+®紫色复合硫酸铵；

Tris 缓冲液；

有些氨基酸用于快速测定，但灵敏度不高；不同蛋白质显色相似，紫外吸收较灵敏。

50–100 毫克禁食

5 到 10 分钟蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基吸收 280 nm 的光，形成各种嘌呤和嘧啶；

多种核苷酸用于色谱柱流出液的检测，核酸的吸光度可校准Folin-酚试剂法（Lowry法）灵敏度高

~5mg 慢

40～60

分钟缩二脲反应；磷钼酸-磷钨酸试剂被酪氨酸和苯丙氨酸还原为硫酸铵；

Tris 缓冲液；

甘氨酸；

各类硫醇的反应时间较长，操作时必须严格控制时间；

不同蛋白质的颜色深度不同，考马斯亮蓝法灵敏度最高。

1–5 毫克快速

5-15分钟当考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其lmax从465nm变为595nm强碱性缓冲液；

-100；

通往SDS的最佳途径；

干扰物质较少；

颜色稳定性；

不同蛋白质颜色深度不同

2.双缩脲法（方法）

1.实验原理

缩二脲（）是两分子尿素在180℃左右加热释放出一分子氨的产物。在强碱性溶液中，缩二脲与CuSO4生成紫色配合物，此反应称为缩二脲反应。凡是含有两个酰胺基或两个直接相连的肽键，或可通过中间碳原子相连的肽键的化合物，都有缩二脲反应。

水

氧=碳=氧

韓國新罕布什尔州

R-CH CH-R

氧=碳 铜碳=氧

韓國新罕布什尔州

R-CH CH-R

水

紫色复合物

紫色复合物的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸组成无关，因此可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰本测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液及某些氨基酸。

此法的优点是速度较快，不同蛋白质显色深浅相近，干扰物质较少，主要缺点是灵敏度较差，因此双缩脲法常用于要求速度快但对结果要求不十分精确的蛋白质测定。

2. 试剂和设备

1.试剂：

（1）标准蛋白溶液：用标准结晶牛血清白蛋白（BSA）或标准酪蛋白配制成10mg/ml的标准蛋白溶液。纯度可利用1mg/ml BSA浓度的A280为0.66进行校正。必要时，也可采用微量凯氏定氮法预先测定标准蛋白，测定蛋白氮含量，计算其纯度。然后根据其纯度，称量配制标准蛋白溶液。牛血清白蛋白用H2O或0.9% NaCl配制，酪蛋白用0.05N NaOH配制。

（2）双缩脲试剂：称取硫酸铜（CuSO4•5H2O）1.50g、酒石酸钾钠（•4H2O）6.0g，溶于500ml水中，搅拌下加入300ml 10%NaOH溶液，加水稀释至1升，装入塑料瓶（或内壁涂有石蜡的瓶子）中保存。此试剂可长期保存，若保存瓶中出现黑色沉淀，需重新配制。

2.设备：

可见光分光光度计、15个大试管、涡旋混合器等。

（三）操作方法

1、标准曲线的测定：取12支试管，分成两组，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml标准蛋白溶液，加水定容至1 ml，再加入4 ml双缩脲试剂，摇匀后，室温（20~25℃）放置30分钟，于540nm处比色测定。以第一支不加蛋白溶液的试管作为空白对照液。取两组测定值的平均值，以蛋白含量为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

2. 样品测定：取2～3个试管，按上述同样方法测定未知样品的蛋白浓度，注意样品浓度不超过10mg/ml。

3. Folin-酚试剂法（Lowry法）

1.实验原理

此法蛋白质测定是最灵敏的方法之一，过去此法是应用最广泛的方法，由于其试剂B（现已可订购）制备困难，近年来已逐渐被考马斯亮蓝法所取代。此法显色原理与双缩脲法相同，只是加入了第二种试剂Folin-酚试剂，以增加显色量，从而提高了蛋白质检测的灵敏度。这两种显色反应产生深蓝色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合形成络合物，Folin-酚试剂中的磷钼酸-磷钨酸被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色（钼蓝和钨蓝的混合色）。在一定条件下，蓝色的深浅与蛋白质的量成正比。

Folin-酚试剂法最早由Lowry提出，确定了蛋白质浓度测定的基本步骤，后来被广泛应用于生物化学领域。此测定方法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多。缺点是耗时较长，需精确控制操作时间。标准曲线不是严格的直线形式，专属性较差，干扰物质多。干扰双缩脲反应的离子，也有可能干扰Lowry反应。而且对后者的影响要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。尿素（0.5%）、硫酸钠（1%）、硝酸钠（1%）、三氯乙酸（0.5%）、乙醇（5%）、乙醚（5%）、丙酮（0.5%）等低浓度溶液对显色无影响，但这些物质浓度较高时，必须制作校准曲线。含有硫酸铵的溶液，只需加浓碳酸钠-氢氧化钠溶液即可显色。如果样品酸性较大，显色后颜色较浅，则碳酸钠-氢氧化钠溶液的浓度必须增加1～2倍。

测定时，加入Folin-酚试剂时要特别小心，因为该试剂只在酸性pH条件下稳定，而上述的还原反应只在pH=10时才发生。因此，当将Folin-酚试剂加入到碱性铜蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便发生还原反应，避免磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏。

该方法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。

该方法可以检测到的最低蛋白质量为5毫克。通常的检测范围是20~250毫克。

2. 试剂和设备

1. 试剂

(1)试剂A：

（A）10g，2g NaOH和0.25g酒石酸钾钠（·4H2O）。溶于500ml蒸馏水中。

（B）将0.5g硫酸铜（CuSO4·5H2O）溶于100ml蒸馏水中，每次使用前，将50份（A）与1份（B）混合，即为试剂A。

（2）试剂B：

在2升磨口回流瓶中，加入钨酸钠（·2H2O）100克、钼酸钠（·2H2O）25克、蒸馏水700毫升，再加入85%磷酸50毫升、浓盐酸100毫升，调匀，接上回流管，小火回流10小时。回流完毕，加入硫酸锂（）150克、蒸馏水50毫升、液溴数滴，开瓶继续煮沸15分钟，以驱除过量的溴。冷却后溶液变黄色（若仍为绿色，则重复加液溴的步骤）。稀释至1升，过滤，将滤液存于棕色试剂瓶中。使用时，用标准NaOH滴定，以酚酞为指示剂，然后适当稀释，加1倍左右的水，使最终酸浓度为1N左右。

(3) 标准蛋白溶液：

准确称取结晶牛血清白蛋白或γ-球蛋白，溶于蒸馏水中，浓度约为250mg/ml。若牛血清白蛋白溶于水时出现浑浊，可用0.9%NaCl溶液代替。

2. 设备

（1）可见光分光光度计

（2）涡旋搅拌器

（3）秒表

（4）16支试管

（三）操作方法

1、标准曲线的测定：取16支大试管，1支为空白，3支为未知样品，将其余试管分成两组，分别加入0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml标准蛋白溶液（浓度为250 mg/ml）。用水定容至1.0 ml，然后每支试管加入5 ml试剂A，在涡旋混合器上快速混匀，室温（20-25℃）放置10分钟。再每支试管加入0.5 ml试剂B（Folin-酚试剂），立即混匀。此步骤混合速度要快，否则显色会减弱。然后室温放置30分钟，以第一支不加蛋白溶液的试管作为空白对照，在700nm处测定每支试管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

注意：由于Lowry反应颜色随时间加深，所以必须精确控制每次操作的时间。即在第一个试管中加入5毫升试剂A后，开始计时，1分钟后，在第二个试管中加入5毫升试剂A，2分钟后，加入第三个试管，依此类推。若所有试管加入试剂A已超过10分钟，可立即在第一个试管中加入0.5毫升试剂B，1分钟后，在第二个试管中加入0.5毫升试剂B，2分钟后，加入第三个试管，依此类推。最后一个试管加完试剂后，再静置30分钟，再开始测光吸收值。每分钟测量一个样品。

在进行多管试管操作时，为了防止出错，每个同学都要事先在实验笔记本中画出下面的表格。表格中给出了每管需要加入的量（ml），并按照从左到右、从上到下的顺序依次加入到每管中。下面两行分别是计算出的每管蛋白质含量（微克）和测得的吸光度值。

Folin-酚试剂法实验表：

管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 标准蛋白 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

（250毫克/毫升）

未知蛋白质 0.2 0.4 0.6

（约250毫克/毫升）

蒸馏水 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.6 0.4

试剂A 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0

试剂B 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

每管蛋白质

含量（毫克）

吸光度值（A700）

2、样品测定：取1ml样品溶液（约含20-250μg蛋白质），按上述方法操作。另取1ml蒸馏水代替样品，作为空白对照。通常样品测定也可与标准曲线测定同时进行。即每支试管后再加入3支试管进行标准曲线测定。如上表中的8、9、10号试管。

根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质的量，计算出样品溶液的蛋白质浓度。

需要注意的是，由于不同的蛋白质中酪氨酸和苯丙氨酸的含量不同，显色深度也往往不同，因此该测定方法通常仅适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。

4. 改进的简单 Folin-酚试剂法

1. 试剂

1、试剂A：碱性铜试剂溶液含有0.5N NaOH、10%、0.1%酒石酸钾和0.05%硫酸铜。配制时注意先将硫酸铜溶解于少量蒸馏水中，最后加入。

2、试剂B：同上基本方法，使用前用蒸馏水稀释8倍。

3. 标准蛋白质溶液：同基本方法。

（二）操作步骤

标准曲线及样品溶液测定操作方法与基本法相同，不同之处是将试剂A改为1ml，室温放置10分钟后，试剂B改为4ml，在55℃恒温水浴中放置5分钟，流水冷却后，在660nm处测定其吸光度值。

改进的快速简便法可得到与Folin-酚试剂法（即Lowry基本法）接近的结果。

5.考马斯亮蓝法（方法）

1.实验原理

双缩脲法（法）和Folin-酚试剂法（Lowry法）明显的缺点和诸多的局限性，促使科学家寻找更好的蛋白质溶液测定方法。

1976年建立的考马斯亮蓝法（方法）是根据蛋白质与染料结合的原理而设计的。此方法与其他几种方法相比具有突出的优点，因此被广泛应用。此方法是目前最灵敏的蛋白质测定方法。

考马斯亮蓝G-250染料在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰位置（lmax）由465nm变为595nm，溶液颜色由棕褐色变为蓝色。研究表明该染料主要与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基结合。

在595nm处测得的吸光度值A595与蛋白质浓度成正比。

该方法的突出优点是：

（1）灵敏度高。估计比Lowry法高约4倍，最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化大，而蛋白质-染料复合物的消光系数较大，因此光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法大得多。

（2）测定快速简便，只需加入一种试剂，仅需5分钟左右即可完成一个样品的测定。由于染料与蛋白质结合的过程在2分钟左右即可完成，其颜色在1小时内即可保持稳定，在5分钟至20分钟之间颜色稳定性最好。因此，无需像Lowry法那样花费时间和严格控制时间。

（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子，Tris缓冲液，糖及蔗糖，甘油，巯基乙醇，EDTA等，对本测定方法均不干扰。

该方法的缺点是：

（1）由于各种蛋白质中精氨酸及芳香族氨基酸的含量不同，用此方法测定不同蛋白质时偏差较大，制作标准曲线时，通常选用γ-球蛋白作为标准蛋白，以减少这种偏差。

（2）仍有一些物质对本方法的测定产生干扰。主要干扰物质有：洗涤剂、X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N NaOH。（与0.1N酸干扰法相同）。

（3）标准曲线也具有一定的非线性，不能用比尔定律进行计算，只能用来测定未知蛋白质的浓度。

2. 试剂和设备

1.试剂：

（1）标准蛋白溶液：用丙种球蛋白或牛血清白蛋白（BSA）配制1.0 mg/ml和0.1 mg/ml标准蛋白溶液。

（2）考马斯亮蓝G-250染料试剂：称取考马斯亮蓝G-，溶于%乙醇中，再加入%磷酸，加水稀释至1升。

2.设备：

（1）可见光分光光度计

（2）涡旋搅拌器

（3）16支试管

（三）操作方法

1. 标准方法

（1）取16支试管，1支为空白，3支为未知样品，其余试管分成两组。按表中顺序加入样品、水和试剂。即在每支试管中加入1.0mg/ml标准蛋白溶液：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，再加去离子水至0.1ml。最后在每支试管中加入5.0ml考马斯亮蓝G-250试剂。每支试管加入后立即放在涡旋混合器上混匀（注意不要混匀太剧烈，避免产生大量难以消除的气泡）。加入的未知样品量分别如下表中第8、9、10支试管所示。

（2）加入试剂后2～5分钟，即可开始用比色皿在分光光度计上595nm处测量每个样品的吸光度值A595。空白对照为1号试管，即加入0.5.0ml G-250试剂。

注意：不要使用石英比色皿（因为很难洗掉污渍），可以使用塑料或玻璃比色皿。使用后立即用少量95％乙醇冲洗以洗掉污渍。塑料比色皿不得长时间浸泡在乙醇或丙酮中。

考马斯亮蓝方法实验表：

管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 标准蛋白 0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10

（1.0毫克/毫升）

未知蛋白质 0.02 0.04 0.06

（约1.0毫克/毫升）

蒸馏水 0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.08 0.06 0.04

考马斯亮蓝

G-250 试剂 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 每管卵子数量

蛋白质含量（毫克）

光吸收值

（A595）

（3）以标准蛋白质量（mg）为横轴，吸光度值A595为纵轴，绘制成标准曲线，以此标准曲线为基础，根据测得的未知样品的A595值，即可算出未知样品的蛋白含量。

0.5 mg BSA/ml 溶液的 A595 约为 0.50。

2. 微量法

当样品中蛋白质浓度较稀（10～100mg/ml）时，可加大进样量（包括加入的水）为0.5ml或1.0ml，空白对照分别为0.5ml或1.0ml H2O，仍加入5.0ml考马斯亮蓝G-250试剂，同时制作相应的标准曲线，并测定595nm处的吸光度值。

0.05 mg 牛血清白蛋白/ml溶液的A595 约为0.29。

6. 紫外吸收法

蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环上含有共轭双键，使蛋白质对紫外光有吸收作用，吸收峰在280nm处，其吸光度（即光密度）与蛋白质含量成正比。另外，蛋白质溶液在238nm处的吸光值与肽键含量成正比。利用蛋白质溶液在某一波长处的吸光值与蛋白质浓度成比例关系，便可测定蛋白质含量。

紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后可循环使用，低浓度的盐，如生化制剂中常用的(NH4)2SO4和大多数缓冲液，不干扰测定，特别适合于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测量蛋白质浓度的变化，而不必知道其绝对值。

该方法的特点是测定蛋白质含量准确度差，干扰物质多。用标准曲线法测定蛋白质含量时，对于酪氨酸、色氨酸含量与标准蛋白质相差较大的蛋白质会有一定的误差，因此该方法适用于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有对紫外光有吸收的物质，如嘌呤、嘧啶、核酸等，干扰会较大。核酸的干扰可以通过查校正表然后计算来适当校正。但由于不同蛋白质、核酸对紫外光的吸收不同，即使经过校正，测定结果仍存在一定的误差。

另外，进行紫外吸收测定时，由于蛋白质吸收峰常常因pH的变化而变化，因此应注意溶液的pH值，测定样品时应使样品的pH与标准曲线的pH一致。

以下是四种紫外线吸收方法：

1. 280nm光吸收法

由于蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm处有最大吸收，且各种蛋白质中这三种氨基酸的含量差别不大，因此，测定蛋白质溶液在280nm处的吸光度值是最常用的紫外吸收法。

测定时，将待测蛋白溶液倒入石英比色皿中，以配制蛋白溶液所用的溶剂（水或缓冲液）作为空白对照，在紫外分光光度计上直接读取280nm处的吸光度值A280。蛋白浓度可控制在0.1~1.0mg/ml左右。通常采用光程为1cm的标准石英比色皿，当盛有1mg/ml浓度的蛋白溶液时，A280约为1.0。由此可立即计算出蛋白的大致浓度。

文献中给出了许多蛋白质在一定浓度和波长下的吸光度值（A1m），根据这个吸光度值可以比较准确地计算出蛋白质浓度。下面的公式列出了蛋白质浓度与（A1m）值（即蛋白质溶液浓度为1%，光程为1cm时的吸光度值）的关系。文献值A1m,λ称为百分吸光系数或比吸光系数。

蛋白质浓度=（A280´10）/A1m,280nm（mg/ml）

（Q 1% 浓度 » 10mg/ml）

例如：牛血清白蛋白：A1m=6.3（280nm）

溶菌酶：A1m=22.8（280nm）

若找不到待测蛋白的A1m值，可选择与待测蛋白酪氨酸、色氨酸含量相近的蛋白作为标准蛋白，采用标准曲线法测定，标准蛋白溶液浓度为1.0mg/ml，常用的标准蛋白为牛血清白蛋白（BSA）。

标准曲线的制定：取6支试管，按下表编号，加入试剂：

管号 1 2 3 4 5 6 BSA（1.0 毫克/毫升） 0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 H2O 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0 A280

以第一管为空白对照，将各管溶液混合后，在紫外分光光度计上测定吸光度A280，以A280为纵坐标，以各管蛋白浓度或蛋白量（mg）为横坐标，绘制成曲线图，标准曲线应为一条直线。利用此标准曲线，可根据测得的未知样品的A280值查出未知样品的蛋白含量。也可根据2～6管的A280值和对应试管中的蛋白浓度，计算出蛋白的A1m,280nm。

2. 280nm和260nm吸收差法

核酸对紫外光有较强的吸收，在280nm处的吸收比蛋白质强10倍（每克），但核酸在260nm处的吸收更强，其吸收峰在260nm附近。核酸在260nm处的消光系数是280nm的两倍，而蛋白质则相反，在280nm处的紫外吸收值大于在260nm处的吸收值。通常：

纯蛋白吸收比：A280/A260 » 1.8

纯核酸吸收比：A280/A260 » 0.5

可以分别测量含有核酸的蛋白质溶液的A280和A260，并根据吸光度的差异，使用以下经验公式计算蛋白质浓度。

蛋白质浓度=1.45×A280-0.74×A260（mg/ml）

该经验公式是利用一系列已知不同浓度比的蛋白质（酵母烯醇化酶）和核酸（酵母核酸）混合溶液的数据建立的。

3. 215nm与225nm吸收差法

当稀释蛋白质溶液因含量低而无法用280nm光吸收测定时，可以利用215nm与225nm处吸收值的差值，通过标准曲线法测定稀释蛋白质溶液的浓度。

使用已知浓度的标准蛋白，制备一系列浓度为20至100 mg/ml的5.0 ml蛋白溶液，测量215 nm和225 nm处的吸光度，计算吸光度差值：

吸收差D=A215-A225

以吸光度差值D为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线，然后测量未知样品的吸光度差值，从标准曲线上查出未知样品的蛋白质浓度。

本方法中，在蛋白质浓度20~100mg/ml范围内，蛋白质浓度与吸光度成正比。NaCl、(NH4)2SO4、0.1M磷酸、硼酸及Tris缓冲液均无明显干扰。但0.1N NaOH、0.1M乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸、巴比妥酸盐等缓冲液在215nm光吸收值较大，必须将其浓度降至0.005M以下才无明显影响。

4. 肽键测定

在238nm处的蛋白质溶液的强度与肽键的数量成比例，因此可以用标准蛋白质溶液制备了50〜500mg/ml的5.0mL蛋白质溶液，并在238nm的情况下使用了A238可以从标准曲线获得未知样品。

当执行蛋白质溶液的色谱柱色谱分离时，洗脱液也可用于检测238 nm处的蛋白质峰。

该方法比280nm的吸收方法更敏感。在确定之前，将物质溶解，然后用水溶解，稀释酸并稀释碱。

参考

1. Boyer，F.，1986年，第55-59页

2. Cai 和Yuan Houji（编辑）：生物学物质的常用化学分析方法，1982年，第93-99页

3. Zhang , Zhang , Li et al., and , 1981, 164-169

页面，高等教育出版社

4. M.Anal，72，248（1976）

2

A.细胞

细胞（T-25）和自旋。

用100 µL裂解在冰上裂解10分钟。

对于500,000个细胞，用20 µL裂解。

在4°C下以14,000 rpm（16,000 g）的旋转10分钟。

到新的管子和。

（测定，A280或BCA）

（我们使用Bio-Rad的测定法。）

取X µL（= Y µg），并与X µL 2倍混合。

煮5分钟。

在RT冷却5分钟。

闪光灯旋转以在凝胶之前放下。

B.凝胶（14.5厘米x 16.5厘米）

插头：

1x凝胶中的1％。

（我制作50毫升，按照我的需要保持它，然后重新浇水。）

凝胶：24毫升9％凝胶

5.4毫升40％ /（29：1混合）

3毫升8x凝胶

15.6毫升水

12 µL TEMED

60 µl 20％

凝胶：8毫升

1毫升40％ /（29：1混合）

2 ml 4x凝胶

5毫升水

8 µL TEMED

21.6 µl 20％

凝胶的C.

玻璃和（1.5毫米厚）。

倒插头（1-2毫米）。

将凝胶倒入梳子孔下方约1厘米（约20毫升）。

用1毫升水密封1-。

（可以在这里停下来，并按照您的意愿离开凝胶。）

凝胶凝固后，用水倒出并冲洗。

倒入凝胶（约5毫升）和梳子。

当凝胶设置时，将其放入凝胶钻机和进度。

在凝胶之前，将水井冲洗掉。

D.凝胶

闪烁后，将其加载到井中。

确保使用。

我们使用15 µL Bio-Rad＃161-0324。

用（35-37 mA，设置为> 300 V）。

通常的时间约为2.5小时。

E.使用凝胶（来自Bio-Rad的Ready Gels）：

凝胶钻机中的凝胶。

（10 µg将）。

使用5 µL。

在200 V（）运行30分钟。

F.

切一块PVDF（-p #IPVH 000 10）。

在房间温度下湿润约30分钟。

并添加1倍直到准备使用。

G.

”“对于生物拉德。

1倍（而不是凝胶）。

- 纸 - 凝胶 - 纸 -

在搅拌板上在4°C下在4°C时1小时1小时。

可能需要。

对于迷你，用冷包进行100 V持续1小时。

何时，在和阻塞。

手

在房间温度下持续60分钟。

在PBS中用0.05％的Tween 20洗涤3 x 10分钟。

在房间温度下持续45分钟。

在PBS中用0.05％的Tween 20洗涤3 x 10分钟。

使用ECL套件（RPN 2106）。

I.印迹

在PBS中，用0.05％的Tween 20进行冲洗。

将印迹放入切成大小的Kapak袋中，而不是印迹。

加约5至10毫升。

尽可能多的空气和密封袋。

进入80°C水浴，持续20分钟。

在PBS中，用0.05％的Tween 20进行冲洗。

用5％的BSA/Tween 20或3％BSA/Tween 20的块约1小时。

为了

裂解：

0.15 m NaCl

5毫米EDTA，pH 8

1％x100

10毫米Tris-CL，pH 7.4

只需使用添加：1：1000 5M DTT

1：1000 100 mm pmsf in

1：1000 5 m e-acid

2x：

130毫米Tris-CL，pH 8.0

20％（v/v）

4.6％（w/v）SD

0.02％蓝色

2％DTT

8x凝胶：100毫升

0.8 g SD（添加最后一个）

36.3 g基地（= 3 m）

pH至8.8与HCl

4x凝胶：100毫升

0.4 g SD（添加最后一个）

6.05 g基座（= 0.5 m）

pH至6.8

10x：1 L

30.3 g基座（= 0.25 m）

144 g（= 1.92 m）

10 g SD（= 1％） - 添加最后一个

不要pH！

10x：1 L

30.3 g基座（= 0.25 m）

144 g（= 1.92 m）

pH是8.3；

使2升为1倍：

400 毫升

200 ml 10x

1400毫升水

：0.5 l

3％血清（V）

在PBS和。

然后添加0.05％的Tween 20。

保持在4°C。

：0.5 L（并保持在4°C）

0.2 m，pH 2.5

0.05％的补间20

3免疫印迹（印迹）是将蛋白质转移到膜上，然后使用抗体检测已知的蛋白质，相应的抗体可以用作检测的主要抗体，对于新基因的表达产物，融合部分的抗体可用于检测。

1.原理

它与杂交方法相似，但是印迹使用聚丙烯酰胺凝胶电泳，检测到的物体是蛋白质，“探针”是抗体，“颜色发育”使用标记的标记的二级抗体，该蛋白质样品是依次键入固定相位的蛋白质的蛋白质，例如蛋白质的蛋白质构造。电泳及其生物活性不变。 。

2.试剂制备

1. SDS-PAGE试剂：请参阅电泳实验。

2.均匀的缓冲液：1.0m tris-hcl（pH 6.8）1.0ml;

3.转移缓冲液：2.9 g甘氨酸;

4. 0.01毫米（pH 7.4）：kcl 0.2g;

5.膜染色：0.2 g 亮蓝色； 2 ml乙醇；

6.彩色溶液：6.0 mg;

3.操作步骤

（I）获得蛋白质样品：在细菌诱导表达后，可以通过电泳加载缓冲液直接裂解真核细胞，并在室温下进行机械或超声均匀的均匀化。年龄。

（iii）转移：（半齐转移）

1.电泳后，将凝胶条切成适当的尺寸，并用传递缓冲液平衡5分钟×3次。

2.膜处理：预切滤纸和NC膜的大小与凝胶条相同，然后将其浸入传输缓冲液10分钟。

3.在阳极板，24层的滤纸，凝胶，24层滤纸和阴极碳板中，将底部的设备从底部转移到顶部。 ，断开功率并取出膜，切开膜条以进行免疫印迹进行测试。

（iv）免疫反应：

1.用0.01m PBS洗涤膜5分钟×3次。

2.添加涂料溶液，并在室温下稳定摇动2小时。

3.丢弃涂料溶液，并用0.01m PBS洗涤膜5分钟×3次。

4.在适当的稀释比中添加初级抗体（用0.01m的PBS稀释，液体必须覆盖整个膜），在4°C下放置超过12小时以上，用1％的BSA代替初级抗体，其余的步骤与实验组相同。

5.丢弃初级抗体和1％BSA，并用0.01m PBS洗涤膜5分钟×4次。

6.加入辣根过氧化物酶偶联的二抗（以适当的稀释率稀释0.01 m PBS），并在室温下稳定摇动2小时。

7.丢弃二抗并用0.01m PBS洗涤膜5分钟×4次。

8.添加颜色开发的溶液，防止光线出现直到出现，然后将其放入双蒸馏水中以终止反应。

四、注意事项

1.应通过初步实验来确定不同蛋白质的初级抗体和次要抗体的稀释时间和温度，以确定最佳条件。

2.必须新鲜准备和使用颜色开发的溶液，并且必须最后添加H2O2。

3. DAB有可能引起癌症，因此在处理时要小心。

4蛋白沉淀法

在生化制剂中，降水主要用于浓度目的，或去除液相中的非必需成分或在固相中的沉淀物。

1.盐盐法通常用于分离和纯化各种蛋白质和酶。

2.有机溶剂沉淀法主要用于分离和纯化生物分子，多糖和核酸产物，有时用于蛋白质沉淀。

3.资产沉淀法用于氨基酸，蛋白质和其他性物质的沉淀。

4.非离子多聚合方法用于分离生物宏。

5.生成多种化合物的盐复合物沉淀，尤其是小分子物质的沉淀。

6.使用热变性和酸基碱变性沉淀法用于选择性去除某些耐热性，并在一定的pH值下轻松退化蛋白质。

第1节盐分析方法

一般而言，所有固体溶液都可以在溶液中添加中性盐，并将其沉淀称为盐分析。

盐分析方法分为两个类别。

1.几个影响盐分析的因素

1.

高浓度的蛋白质溶液可以节省盐的剂量，但是如果蛋白质浓度太高，那么在低浓度的盐中，蛋白质的浓度太高，蛋白质的浓度太