Engineering P450 TamI 作为选择性后期 C−H 官能化和替兰霉素抗生素环氧化的迭代生物催化剂的研究

Engineering P450 TamI 作为选择性后期 C−H 官能化和替兰霉素抗生素环氧化的迭代生物催化剂的研究

标题：P450 TamI 作为晚期 C−H 和

期刊：ACS

年份：2021

影响因子：13.7

作者：Rosa V.、S. Wald、Jin Yi Tan, A.、Yogan、Sean A., J.、Marc-、John、KN Houk 和 David H.

作者单位：of Los

概括

P450酶是一类强大的生物催化剂，能选择性氧化复杂天然产物的C−H键，广泛应用于酶级联反应。最近，报道了一种多功能细菌P450 TamI的结构，并阐明了其与底物结合的分子机制。该酶在底物的不同碳原子上具有严格的反应顺序。本研究通过在TamI中的和位点设计相应的突变体，改变了催化反应中的天然选择性和步骤顺序。同时，设计了一种突变体TamI，其可以在不需要氧化伙伴TamL的帮助的情况下，催化四步氧化反应生成泰达霉素B。通过TamI介导的酶反应合成了五种具有生物活性的泰达霉素衍生物，量子力学计算和MD模拟对P450 TamI酶催化选择性的迭代变化和增强的顺序氧化能力提供了机理分析。

研究内容

1. 具有不同选择性的 TamI 突变体的鉴定和设计

据报道，细胞色素P450 TamI酶可以在底物的不同碳原子上催化3个高选择性的顺序氧化反应生成产物（5）（图1）。产物分析显示，TamI L244A突变体形成了少量新的双氧化同源物（11）（图2A，泳道8）；TamI L101A生成了一个未知的单氧化同源物（6）和两个新的双氧化同源物。TamI L295V优先形成产物（7）（图2A，泳道10），而TamI L295A选择性地生成了产物（9）和（10）。

图1 P450 TamI 催化的迭代氧化反应。在步骤1中，TamI 催化1 中 C10 的羟基化；在步骤2中，黄素蛋白 TamL 将2 的 C10 羟基氧化为酮。在步骤3中，TamI 将3 的 C11/12 环氧化为烯烃；在步骤4中，TamI 将4 的 C18 羟基化，得到最终产物5。

图 2 TamI 突变体的终点分析。

(A) 选定反应的 LC-MS 分析，标准品包括 (1)-(5)（1-5 泳道），化合物 2-5 因异构化而出现姊妹峰。星号用于标记生物标志物（7-9 泳道）。(B) 野生型和突变型 TamI 与 1 的体外酶反应

2. 设计具有更强迭代能力的Taml突变体

早期研究表明，黄素氧化酶TamL是（2）转化为（3）的关键因素（图1，步骤2）。本研究设计了一种不需要TamL的TamI突变体，直接进行四步氧化反应，从（1）到（5）。可以看出，空间位阻较小的氨基酸取代可以削弱底物在活性位点的构象限制，有利于较高氧化状态的泰达霉素中间体的结合，从而在不存在黄素蛋白TamL的情况下实现底物的连续氧化。

3. TamI和L295A直接催化步骤3生成泰达霉素L（6）

与天然反应第一步需要C10位羟基化不同，TamI和L295A直接催化（1）的C11/12环氧化（图3），生成新的泰达霉素L氧化同源物（6），表明TamI的逐步氧化反应被打破。密度泛函理论（DFT）从1开始计算了C10羟基化、C11/12（R/S）环氧化、C18羟基化的转变能垒，结果表明，烯烃环氧化反应的能量最高（2.6kcal/mol）。这表明TamI和L295A中蛋白质构象的变化对于催化难以发生的反应具有重要意义。同时，分析了TamI和WT与（1）的MD模拟，结果表明，呈现出两种主要的底物结合构象。第一种构象与WT相似，C10氢处于正确的几何构型，有利于C−H氧化，第二种构象更有利于烯烃环氧化（图4A）。此外，TamI L295A与（1）的MD模拟结果表明，C11原子与血红素中心的接近度在大部分模拟过程中保持不变，与C11/12环氧化一致。这些结果表明，底物周围的疏水相互作用是将TamI中的氧化途径从烯丙基C−H氧化切换到环氧化的关键因素。

图 3 TamI 突变体催化产生具有不同选择性的新型泰达霉素同源物。TamI 催化四步氧化级联反应。新代谢物包括泰达霉素 L (6)、M (7)、N (8)、O (9) 和 O′ (10)

图4 TamI的计算分析。TamI突变体与底物的两种结合模式使得C11/12环氧化（步骤3）可以与C10羟基化（步骤1）竞争。第二种结合姿势（蓝色）促进了环氧化反应，支持了实验结果。

4. TamI L295V 催化步骤 1 和 3（省略步骤 2），生成泰达霉素 M (7)

与 WT 催化反应类似，TamI L295V 首先催化 (1) 形成 (2)。然而，该突变体可以直接催化 (2) 形成双氧同源物泰达霉素 M (7)（图 3）。L295V 和 (2) 的 MD 模拟表明，在初始最小化后实现了较低的能量构象，其中 C11 相对于其他反应位置和氧化铁最接近，这与 C11/12 环氧化一致。此外，在 sp。在 307-9 ΔtamL 黄素蛋白突变体的培养基中检测到 (2) 和 (7) 的产生。我们推断 TamI WT 也可以在没有黄素蛋白 ( 7) 的情况下催化 (2) 的环氧化，这一假设得到了以下观察结果的支持：当 (2) 被纯化的 TamI WT 催化时会产生微量的 (7)。

5. TamI 催化步骤 3 和 4 生成霉素 N (8)

TamI催化（1）生成中间体（6）后，再催化（6）生成双氧同系物泰达霉素N（8），该同系物与典型的不具有该性质的泰达霉素同系物相似。C18位羟基部分带负电，降低了相邻质子周围的电子云密度，使C18的化学位移增加到58.9 ppm，而C18和C10羟基化过渡能垒的化学位移为15−16 ppm。C10（S）羟基化与C18羟基化的反应能垒基本没有能量差异，前者的能量较低（图5）。这与实验观察结果一致，即 TamI 虽然 (8) 仅由 (6) 生成，但使用突变体和 (6) 的 MD 模拟表明，在整个模拟过程中，C18 最接近血红素铁氧化位置，与步骤 4 一致。将 MD 模拟的 Oheme-C18 氢距离和 Oheme–C18H-C18 二面角几何形状与 QM 计算的理想过渡态进行比较，表明 TamI 活性位点的几何形状有利于 C18 羟基化。

图 5 TamI 区域选择性的 DFT 计算。以 (6) 为底物，C10 和 C18 上的 C−H 氧化反应的内能

综上所述

TamI的研究为多功能P450酶对复杂化合物的不同选择性氧化机制提供了新的见解。TamI活性位点的、、和的突变使催化剂控制的迭代氧化级联反应成为可能。此外，TamI可以选择性地氧化C18甲基位置，逆转烯丙基和烯丙基C−H键之间的位点选择性，并氧化非烯丙基活化的C−H键。这一特性使我们能够酶促合成新的化合物。结果表明，可以通过蛋白质工程改造P450同源物来催化多步氧化反应。

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结尾