首个细胞色素 P450 酶全长精细三维结构解析，破解数十年科学难题

首个细胞色素 P450 酶全长精细三维结构解析，破解数十年科学难题

通用生物催化剂全长晶体结构被破解

完整酶结构由郭瑞婷提供

电子转移机制。图片由郭瑞婷提供

5月29日，《自然通讯》在线发表了细胞色素P450酶的第一个全长详细三维结构，解决了几十年来一直未解的科学难题。

该项工作由湖北大学生命科学学院、省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室陈春启、马立新、郭瑞婷教授完成，解析了P450酶的晶体结构，阐明了分子内电子的转移过程，为深入理解P450的结构和完整作用机理提供了重要指导，对P450酶在医药、工业领域的应用具有重要价值。

通用生物催化剂

细胞色素P450是一种酶蛋白，1955年首次在小鼠肝细胞中发现，因其与一氧化碳结合时的还原态吸收光谱波长约为450nm而得名。

该蛋白由血红素结构域和含有黄素单核苷酸（FMN）的还原酶结构域组成；这两部分由含有铁硫簇的铁氧还蛋白结构域连接。“细胞色素P450是一个大的酶家族，简称CYP，参与多种天然产物的合成途径以及毒物、药物的代谢反应。”论文通讯作者陈春琪告诉《中国科学报》，在植物中，P450家族参与一些特殊化合物的合成，如青蒿素、紫杉醇等；在人体中，P450家族主要参与解毒过程，如对可致癌的黄曲霉毒素的解毒。

这是因为P450具有很高的催化通用性，涉及羟基化、环氧化、环化等20余种反应，其底物谱极广，可识别芳香族、聚酮、萜类、多肽、糖等多种类型的底物，被誉为“万能生物催化剂”。

它还具有较高的区域选择性和立体选择性，能特异性地识别结构位点和方向。另外，P450酶的底物结合区域可塑性强，可通过酶工程改变底物谱，在重要化学品和药物的制造中具有巨大的应用潜力。

因此，药物活化和代谢主要由CYP酶家族负责，该酶家族约占生物体此类代谢的75％。

P450系统广泛存在于所有生物体甚至病毒中，目前已发现的P450系统超过18000个。人体中已发现57种以上的P450系统，大多数为膜蛋白，主要分布在线粒体膜或内质网中。但在大肠杆菌中尚未发现此类酶蛋白的踪迹。

“绝大多数P450酶都需要氧化还原酶提供电子，激活底物结合区的血红素，进而进行底物转化。”陈春启说，建立P450系统，需要找到同源或匹配的氧化还原酶。

在9个P450系统家族中，只有两个家族在同一条多肽链上存在自己的氧化还原酶，称为自给性P450酶，这些酶主要来源于细菌；其他P450系统则需要从外界获得与之相匹配的氧化还原酶，这主要发生在动物身上。

“自给自足的P450酶是生物技术应用领域极具吸引力的生物催化剂，因此，自给自足的P450酶内电子是如何转移的是一个非常有趣且重要的课题。”该论文的通讯作者郭瑞婷告诉《中国科学报》，此前科学家们对P450系统中血红素、FMN等结构域有了比较清晰的认识，但对中间的连接部分一直不甚了解，也缺乏全长的精细结构。

“在蛋白质纯化、晶体培养过程中，P450酶很容易在中途发生断裂或降解，很难获得完整的全长三维结构。”陈春启说。

获取全长 P450 的详细三维结构

目前已知的自给性P450酶有两种，第一种以巨大芽孢杆菌为代表，其氮端由血红素结构域组成，碳端由P450还原酶（CPR）组成，电子传递方向由碳端向氮端。虽然该类P450酶的全长精细结构尚不清楚，但关于该类P450酶的电子传递机制已有一些粗略的理论。

第一类自给自足的P450酶的结构域排列。图片由郭瑞婷提供

第二种类型，即本研究涉及的类型，由氮端的血红素结构域和碳端的邻苯二甲酸双加氧酶还原酶样结构域（PDR）组成，其中包含FMN依赖性还原酶结构域和铁氧还蛋白结构域。

第二种自给式P450酶结构域排列郭瑞婷提供

由于30多年来缺乏全长蛋白质结构信息，在本研究之前，自给自足的P450酶的多肽链中电子如何从血红素的碳端转移到氮端尚不清楚。

英国曼彻斯特大学化学生物学教授 L. 表示：“获得全长酶是一项了不起的成就。”包括她所在的团队在内的许多团队都试图解析这些结构，因为它们作为生物催化剂具有巨大的应用潜力。

“可以说晶体制备已经超越了科学，几乎成为一门艺术。”陈春启说，获得完整的大蛋白质晶体结构的难度可想而知。

研究中所用的晶体相对稳定，加上郭瑞婷多年来在晶体制备和结构分析方面的丰富经验，使得他们能够利用X射线晶体学分析其完整的晶体结构。

结构分析显示，在该酶中，FMN与铁硫簇的距离足够近，可以实现直接的电子转移；但血红素距离铁硫簇太远，无法实现直接的电子转移，而是依靠5个“二手”氨基酸来实现转移。

“我们分析了全长的晶体结构，建立了清晰的酶结构模型。”郭瑞婷说，这种连续的多肽折叠成三个结构域，由两个连接肽连接，从氮端到碳端，它们分别是：血红素结合结构域、还原酶结构域和铁氧还蛋白结构域。

郭瑞婷介绍，经过结构分析发现，三个结构域的排布非常符合电子传递的方向。血红素结合结构域的底物结合区域朝外，有利于底物的进入和结合，说明结构的排布相当合理。其中，还原酶结构域与铁氧还蛋白结构域之间的直线距离为7.9Å，有利于电子的直接转移。

“科学家普遍认为，电子可以在8埃以内的距离上直接传输。”郭瑞婷说。

另一方面，铁氧还蛋白结构域和血红素之间的直线距离为25.3 Å，超过了目前公认的有效直接电子转移距离。

5 个“”转移电子

“其他辅助因子帮助两个氧化还原中心之间进行电子转移的可能性较小”，郭瑞婷解释道，因为结构显示两者之间的通道较窄，缺乏其他辅助因子结合的特征。另一方面，考虑到氨基酸也是电子载体，两者之间的氨基酸也可能在电子转移过程中发挥重要作用。

“现在我们有机会设计还原酶结构域和电子传递途径，”陈春启说。

为了分析这些氨基酸侧链基团对酶活性的影响，他们将这些位点突变为丙氨酸，并测量产生的产物的量，以评估每种氨基酸所起的作用。

郭瑞婷介绍，酶活性检测结果显示，R388、R718、E723、S726、E729等丙氨酸突变体的活性明显降低，通过在结构上重新标记这些位点，可以看出电子传递的大致方向。

R378A突变蛋白缺乏血红素引起的红色，一氧化碳处理后也没有出现吸收峰偏移。另外R378的位置靠近血红素，因此推测R378可能与结合血红素有关。因此R378A突变引起的效应更为复杂，需要进一步的实验来确定该位点对电子传递的影响。

血红素通道[2Fe-2S]及氨基酸突变验证。图片由郭瑞婷提供

“知道了氨基酸在电子传递过程中的作用后，我们可以考虑寻找其他有效的替代氨基酸，提高电子传递效率。”郭瑞婷解释道，这就像是给“二传手”换上了一条更长的臂，让电子能够更快地传递。

这一设计将提高催化反应的效率。P450全长结构的解析，是理解自给自足P450酶催化机理的一个非常重要的里程碑，对P450酶的改造和应用具有重要的指导意义。（来源：中国科学报 李晨）

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