核黄素：人体必需的微量营养元素及其微生物发酵法生产策略

核黄素：人体必需的微量营养元素及其微生物发酵法生产策略

编者注

核黄素又称维生素B2，是人体必需的微量营养素，必须通过外源食物或营养补充剂获得。在重体力劳动、精神紧张、怀孕和青少年成长期，人体对核黄素的反应需求会增加。核黄素的合成方法主要有全化学合成法、化学半合成法和微生物发酵法三种。微生物发酵是目前核黄素最好的生产方法。

《中国工程院学报》2022年第5期发表了中国农业科学院都市农业研究所甘仁友副研究员研究团队的文章《微生物中核黄素合成的生物技术策略》。文章简要介绍了核黄素在人类健康中的作用及其工业化生产的历史进程，详细介绍了核黄素在细菌和真菌中的生物合成途径，总结了利用现有微生物发酵方法生产核黄素的方法。方法和策略包括优化发酵条件以及通过化学诱变和代谢工程技术构建高产核黄素菌株。文章指出，近年来，产生核黄素的微生物越来越受到人们的关注，其中真菌（水假单胞菌和棉氏阿什氏菌）和细菌（枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和乳酸菌）是理想的产生核黄素的细胞工厂，因此，它们是提高发酵食品中核黄素含量或开发具有更高营养价值和人类健康益处的新型核黄素生物强化食品的优秀候选菌株。使用精心挑选的菌株原位生产核黄素的概念开辟了一条为不同或特定人群（如老年人、儿童、孕妇、运动员、素食主义者和青少年）开发新型食品的方法。

一、简介

核黄素（RF）又称维生素B2（图1），是一种水溶性B族维生素，具有较高的热稳定性（熔点：280°C）。在酸性或中性溶液中对热稳定，并具有短期稳定性。随着时间的推移加热不会被破坏，但在碱性溶液中加热很容易被破坏。同时，核黄素也是一种光敏物质，在短波辐射（<400 nm）下会发生光降解。核黄素是人体必需的微量元素之一，具有广泛的生理功能。已被世界卫生组织（WHO）列为评价人体生长发育和营养状况的六大指标之一。健康成人每日平均需要核黄素0.3至1.8毫克。当每日摄入量低于0.2～0.3毫克时，就会出现核黄素缺乏的症状。在某些特殊情况下，如重体力劳动、精神压力、怀孕和青春期成长等，人体对核黄素的需求量会增加。目前，核黄素缺乏已引起世界许多国家的关注。

图 1. 核黄素的化学结构。

核黄素是维持细胞正常功能不可缺少的营养素。摄取后，核黄素在细胞内通过黄素激酶和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）合酶的作用分别转化为黄素单核苷酸（FMN）和FAD。核黄素的这两种主要生物活性衍生物随后充当电子载体，以及部分催化氧化还原反应的酶，例如琥珀酸脱氢酶、细胞色素c还原酶、葡萄糖氧化酶、醛氧化酶和黄嘌呤氧化酶），这是参与氧化还原反应的重要辅助因子。一系列对人体新陈代谢至关重要的氧化还原反应。动物研究发现，核黄素可以影响铁离子的吸收和代谢，补充核黄素可以提高锌离子和铁离子的吸收。鉴于这两种微量金属在细胞增殖中的关键作用，核黄素也将间接地在生长中发挥积极作用。相反，核黄素缺乏会减少铁离子的吸收、储存和利用，导致人体生长迟缓。此外，核黄素缺乏或转运障碍可能导致白内障、神经系统疾病、心血管异常，甚至癌症。因此，保证每日规律饮食摄入核黄素对于预防核黄素缺乏相关疾病是必要的。

核黄素与大多数维生素一样，不能在人体内合成。因此，人体内的核黄素主要从日常饮食中获取，也可能来自人体肠道菌群。核黄素天然存在于多种食物中，含量不同。动物源性食品比天然植物源性食品（例如内脏、牛奶和鸡蛋）是更好的核黄素来源。此外，一些绿色蔬菜和豆类还含有一定量的核黄素。日常饮食中的核黄素虽然易于吸收，但由于其水溶性，无法在人体内大量储存。摄入过多的核黄素会通过尿液和粪便排出体外。

2、核黄素生产工艺

2012年，全球核黄素年产量和销售量达到9000多吨，其中约1800吨用于制药和饮料行业，约7200吨用于动物饲料生产。随着功能性食品和动物饲料行业的发展，对核黄素的需求量也不断增加。目前核黄素的生产工艺主要有全化学合成、化学半合成和微生物发酵三种。其中，微生物发酵方法可分为两类：传统产核黄素微生物发酵和基因工程微生物发酵。

(1)全化学合成法

核黄素的完整化学合成以D-核糖或D-葡萄糖为起始原料，经过6～9步化学反应，包括氧化、取代、易位、酸化、内酯化、还原、缩合、偶联和环化，合成核黄素。可见，核黄素的全化学合成是一个复杂且耗时的过程（图2），生产成本高，环境污染严重。另外，用该方法制备的核黄素产品中往往含有难以消除的杂质，且具有一定的毒性。因此，完全化学合成方法逐渐被微生物发酵方法所取代。

图2.核黄素的完整化学合成途径。

(2)化学半合成法

核黄素的化学半合成工艺采用微生物发酵与全化学合成相结合的方式。首先利用微生物发酵将D-葡萄糖转化为D-核糖，然后将发酵产生的D-核糖作为合成核黄素的主要原料。化学合成。由D-葡萄糖发酵生产D-核糖可以简化核黄素的合成工艺，降低生产成本。这也是全化学合成与化学半合成的主要区别。但由于化学半合成法所使用的化学添加剂难以去除，导致最终产品残留量较高，不适合大规模生产核黄素。

(3)微生物发酵法

20世纪中叶以来，微生物发酵已用于核黄素的商业化生产，最初使用的核黄素生产微生物主要有3类，包括一类细菌[丙酮丁醇梭菌( )]和两类真菌[ ]。 ( ) 和阿水假单胞菌 ( )]。然而，由于发酵周期长、产量低，早期的微生物发酵方法无法与化学合成方法竞争，因此难以大规模商业化。后来，随着基因工程技术的发展，成功构建了生产核黄素的基因工程菌，如枯草芽孢杆菌（ ）和产氨棒状杆菌（）等。这些细菌可以有效地将D-葡萄糖转化为核黄素，从而显着缩短生产周期并提高核黄素产量。因此，基因工程菌的应用终于使微生物发酵生产核黄素的商业化成为现实。

总体来说，目前微生物发酵法生产核黄素具有生产周期短、原料简单、收率高的优点，且生产成本远低于全化学合成和化学半合成。

3.核黄素的微生物合成

在真菌、酵母和真细菌等产生核黄素的微生物中，一分子核黄素的生物合成需要三分子磷酸鸟苷（GTP）和两分子5-磷酸核酮糖。如图3所示，作为核黄素生物合成的初始底物之一，GTP(1)在GTP环化水解酶II(酶1)催化的咪唑开环水解反应中从核糖基侧链分离。通过水解除去无机焦磷酸基团，生成 2,5-二氨基-6-核糖氨基-4(3H)-嘧啶酮-5'-磷酸盐 (DARPP, 2)。 DARPP (2) 随后通过两个连续的还原和脱氨反应转化为 5-氨基-6-核糖氨基-2,4(1H,3H)-嘧啶二酮-5'-磷酸 (ArPP, 5)。然而，这两个反应的顺序根据微生物的类型而变化。在真菌中，DARPP(2)的核糖基侧链在还原酶的催化下首先还原为核糖醇侧链，产生中间体2,5-二氨基-5-核糖醇氨基-4(3H)-嘧啶酮-5'-磷酸(DArPP,4)进一步被脱氨酶脱氨形成ArPP(5)。然而，在真细菌中，DARPP(2)首先在脱氨酶-磷酸(ARPP，3 ），又在还原酶的作用下发生呋喃核糖基还原和开环反应，生成ArPP（5）。

可以看出，DARPP在细菌和真菌中的还原和脱氨反应的顺序是相反的。在随后的反应中，ArPP(5)在非特异性磷酸酶的作用下进一步脱去磷酸基团，转化为5-氨基-6-核糖氨基-2,4(1H,3H)-嘧啶二酮(ArP,6) ，但这种磷酸酶尚未被鉴定。近期研究发现，在枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、多形拟杆菌等菌株中，卤酸脱卤酶（HAD）超家族蛋白可以催化ArPP（5）的去磷酸化，与酶4的作用效果一致。另一方面，核酮糖5-磷酸(7)作为核黄素生物合成的另一种初始底物，首先被磷酸丁酮合酶(酶5)催化，并重新排列其分子骨架，形成3, 4-二羟基-2-丁酮-4 -磷酸盐（3,4--2--4-，DHBP，8）。随后，在二氧四氢蝶啶合酶（或核黄素合酶β亚基，酶6）的作用下，DHBP与Arp（6）发生缩合反应，生成6,7-二甲基-8-核糖醇-二氧四氢蝶啶（6,7- 8-，DMRL，9)。 DMRL作为核黄素合成的直接前体物质，在核黄素合酶（或核黄素合酶α亚基，酶7）的作用下，通过特殊的歧化反应，最终转化为核黄素（10）和ArPP。 （5）。其中，产物ArPP(5)可再次用于另一种核黄素分子的生物合成。

图 3.核黄素生物合成途径。化合物1是三磷酸鸟苷(GTP)； 2是2，5-二氨基-6-核糖氨基-4(3H)-嘧啶酮-5'-磷酸酯(DARPP)； 3是5-氨基-6-核糖氨基-2,4(1H,3H)-嘧啶酮-5'-磷酸酯(ARPP)； 4是2，5-二氨基-5-核糖醇氨基-4(3H)-嘧啶酮-5'-磷酸酯(DArPP)； 5是5-氨基-6-核糖醇氨基-2,4(1H,3H)-嘧啶二酮-5'-磷酸酯(ArPP)； 6是5-氨基-6-核糖醇氨基-2,4(1H,3H)-嘧啶二酮(ArP)； 7是5-磷酸核酮糖； 8是3,4-二羟基-2-丁酮-4-磷酸酯(DHBP)； 9是6，7-二甲基-8-核糖醇-二氧四氢蝶啶(DMRL)； 10是核黄素。酶1：GTP环水解酶II；酶2/酶3：双功能核黄素特异性嘧啶脱氨酶/还原酶；酶4：非特异性磷酸酶；酶5：DHBP合酶；酶6：双加氧酶四氢蝶呤合酶或核黄素合酶β-亚基；酶7：核黄素合酶或核黄素合酶α-亚基。

核黄素的微生物发酵合成通常使用真菌和细菌。目前的研究重点是两种酵母样真菌（阿水假单胞菌和棉氏阿什比亚氏菌）和三种细菌（枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和乳酸杆菌）的应用。对于阿水假单胞菌和棉阿什比亚两种真菌来说，可以通过化学诱变和基因工程实现定向进化，调节核黄素生物合成，提高核黄素产量。然而，修饰真菌通常需要较长的发酵时间、高粘度的发酵液，并且需要在含有多种成分的培养基中培养。这些不利因素都会增加核黄素后期分离纯化的难度，增加生产成本。另外，培养基中应不断补充外源物质（不饱和脂肪酸），以提高真菌的生物合成能力。相比之下，利用细菌的优势更为明显，如发酵周期短、培养基成分简单、细菌可利用的基因工程技术也比较完善。

(一)真菌

1.阿水假单胞菌

阿水假单胞菌( ashui，E.)是目前用于工业发酵生产核黄素的主要菌株之一，因此其发酵特性也得到了较为全面和详细的研究。并证明了不同碳源和氮源及其初始浓度对 E. NRRL 1363 核黄素生产的影响。在此基础上，开展了核黄素工业生产工艺优化的一系列研究。报道了pH值对水假单胞菌胞外核黄素产生的影响。结果表明，pH 4.5和5.5时细胞外核黄素产量较高，而pH 3.5和8.5时几乎没有核黄素合成。通过紫外诱变获得核黄素高产突变菌株E.DT1。但该菌株产量低、遗传特性不稳定，限制了其核黄素产量的进一步提高。根据微生物的代谢调节机制，使用对核黄素及其代谢物类似物具有抗性的突变菌株，可以减少核黄素生物合成途径中某些关键酶的反馈抑制，从而可能增加核黄素的积累。 。然而，水假单胞菌不能在无机盐培养基中生长，也很难找到适合其生长的合成培养基。因此，寻找合适的合成培养基将提高筛选稳定产核黄素阿水假单胞菌突变菌株的成功率，这些突变菌株的进一步应用将提高核黄素产量。

2. 未命名念珠菌

作为天然核黄素生产菌株，匿名假丝酵母( ，C.，C.)已用于核黄素的工业生产。尽管这种酵母近年来已不再用于工业生产，但其在基因工程领域的研究仍在继续，并取得了很多进展。这些研究进展表明，无名假丝酵母有潜力转化为高核黄素产量的新型基因工程菌株。

以TEF1为启动子，构建携带汉逊德巴利酵母（ ）FAD1基因（编码FAD合酶）和FMN1基因（编码核黄素激酶）的质粒-FAD1，并将该质粒转入重组假丝酵母T-OP 13-76中FMN1基因过表达。获得的重组菌株中，一株名为C.T-FD-FM27的菌株在最佳条件下分批发酵40 h后，产黄素腺嘌呤二核苷酸451 mg∙L-1。 （FAD）。这是第一份关于构建高 FAD 产量的酵母菌株的报告。

在另一项研究中，等人。以不可回复的C.AF-4菌株为起始菌株，构建了共过表达SEF1、RIB1和RIB7基因的高核黄素生产菌株。使用7L实验室生物反应器进行补料分批发酵实验。该菌株在优化后的培养基中核黄素产量达到16.4 g∙L-1，是目前已知最高的核黄素产量。菌株之一。此外，当将修饰的PRS3和ADE4基因（分别编码PRPP合酶和PRPP酰胺转移酶，均源自汉逊德巴利酵母）引入上述构建的菌株时，其核黄素产量增加两倍。 。

3. 棉阿什比亚 ( )

丝状半子囊菌 最初是从患病的棉花植株 (sp.) 中分离出来的，随后被发现是一种天然产生核黄素的菌株。在营养胁迫条件下，这种真菌的菌丝体分化形成孢子囊，当孢子囊内形成孢子时，会合成核黄素，这可能有助于保护透明且对紫外线敏感的孢子。经过数十年的菌种改进，1990年建立了以棉球菌（ ，A.）为基础的核黄素生物技术合成方法，使核黄素的单位生产率达到了较高水平，取代了以往多级化学反应合成核黄素的方法。棉阿什比亚棉具有天然的核黄素合成能力，用于核黄素的工业生产已有20多年的历史。同时，阿什比亚棉也具有重要的科学价值。它不仅在生物技术领域具有广阔的潜在应用前景，而且被广泛用作真菌发育和进化生物学研究的模式菌株。近年来，棉麻在产业应用和基础研究方面均取得了丰硕成果，推动了高端基因工程分子和生物信息学工具的发展，充分发挥了其生物技术应用潜力。

除了核黄素生产之外，近年来对棉阿什比亚氏菌的其他生物技术应用的研究也取得了重大进展。尽管如此，基于棉阿什氏菌的核黄素生产工艺的优化以及高核黄素产量的棉氏阿什氏菌菌株的开发仍然是许多研究者的主要目标，目前的研究大多集中在分子水平。利用 13C 同位素标记技术分析核黄素生产真菌 A.B2 的碳通量。本研究以植物油为原料，采用复杂的工业发酵工艺生产核黄素。根据13C标记数据，甲酸和丝氨酸是可以积极影响核黄素生物合成的一碳供体，而甘氨酸是核黄素嘧啶环的唯一二碳供体。此外，核黄素合成后期内源甲酸的积累可以克服细胞早期一碳代谢途径的严重瓶颈问题，少量、批量补充甲酸和丝氨酸可以增强核黄素合成的效率。细胞内甲酸和丝氨酸的可用性，使得细胞核黄素产量增加了45%。随后，第一次，等人。成功实现了A.B2菌株生长阶段和核黄素生物合成阶段碳通量的定量计算。结果表明，酵母抽提物作为常用的工业培养基成分，是菌株生长过程中的主要碳源，对菌株的生长有显着影响。然而，菜籽油是核黄素合成的主要碳源，因此对核黄素生产影响最大。这些结果凸显了碳源对于核黄素生产的重要性，需要仔细选择。

该研究为A.B2菌株在复杂工业发酵条件下的物质代谢带来了一些新的见解，对于进一步的菌株改良和工艺优化具有重要的指导意义。郑等人。利用13C同位素标记技术对野生阿什比亚棉氏菌（ATCC 10895）及其核黄素高产突变株（）的代谢通量进行了分析，并在此基础上进一步分析了中心两株菌株的代谢通量。碳代谢途径的差异，以分析棉豆核黄素过量合成途径。代谢通量分析结果表明，突变株磷酸戊糖途径（PPP）-磷酸戊糖合成的代谢通量比野生株高9%，嘌呤合成途径（PSP）的代谢通量比野生株高9%。突变株的核黄素合成比野生株高9%。其含量（1.6%）是野生株（0.1%）的16倍。这些结果表明， 突变株中PPP和PSP代谢流的变化引起的GTP代谢流的增加是核黄素产量增加的主要原因。这也说明增强与PPP和PSP有关。 PSP 相关基因的表达是增加核黄素产量的一种选择。 Silva等人以A. ATCC 10895为起始菌株。利用基因工程技术构建了尿苷/尿嘧啶营养缺陷型菌株A.，并研究了阻断其嘧啶从头生物合成途径（de novo）的效果。影响。结果表明，该菌株在常规固体天然培养基上的核黄素产量得到提高，外源添加尿苷/尿嘧啶抑制了核黄素产量。此外，高浓度的尿嘧啶抑制了该菌株及其起始菌株（A.）的生长，而过量的尿苷则加速了它们的生长。本研究首次通过实验探讨棉花阿斯巴甜生物合成途径相关基因的变化对其核黄素产生的影响。

作为天然高核黄素产生菌株，棉阿什比亚氏菌必须确保鸟嘌呤核苷酸途径（ ）中的代谢通量较高水平，以提高核黄素限制前体物质 GTP 的生物利用度。因此，进一步提高该真菌的核黄素产量需要充分了解其GTP生物合成途径中关键酶的特性。在嘌呤生物合成途径中，肌苷酸（-5'-，IMP）是腺苷酸（AMP）和单磷酸鸟苷（GMP）的共同前体物质，由肌苷酸脱氢酶（-5'-，IMPDH）激活在IMPDH的催化下氧化成黄酸(-5'-, XMP)。该反应是限速反应。经过一系列连续的反应，XMP最终转化为GTP。可见IMPDH是嘌呤生物合成途径中重要的代谢瓶颈。但从代谢工程技术的角度来看，这种酶的基因改造具有很强的可操作性。布伊等人。对 中的 IMPDH 进行了详细的功能分析和结构表征。结果表明，当A. ATCC 10895菌株的IMPDH基因过表达时，鸟嘌呤生物合成途径的代谢通量增加，最终使该菌株的核黄素产量增加40%。这项研究极大地促进了旨在提高棉阿什比亚核黄素产量的代谢工程工具的开发。 -阿马罗等人。分析了各rib基因对棉阿什比亚核黄素产量的影响，发现当rib基因转录水平和底物GTP生物利用度较低时，棉阿什比亚核黄素产量减少。核黄素的合成会受到阻碍；当rib基因（最多5个）一起过表达时，细菌的核黄素产量会显着增加。研究还发现，编码腺苷酸琥珀酸合酶（腺苷酸琥珀酸合酶）并调节嘌呤途径腺苷酸（-5'-，AMP）分支第一步反应的ADE12基因，当其失活或处于低活性状态时，会对核黄素产生负面影响。 - 表示。合成具有积极影响。此外，-Amaro 等人。还利用代谢工程技术构建了 菌株A330，该菌株A330过表达所有rib基因，低表达ADE12基因。该菌株核黄素产量高达523 mg·L-1，为野生最高。菌株（A. ATCC 10895）。这项研究为增加工业核黄素产量提供了一种可控且可扩展的策略。

帕克等人。采用差异诱变技术，获得高核黄素产量的棉阿什比亚突变株()。使用优化后的培养基，该菌株在3L发酵罐中的核黄素产量为13.7 g·L-1，是野生菌株（A. ATTC 10895）产量的9倍。蛋白质组学和DNA微阵列分析结果显示，涉及嘌呤和核黄素生物合成途径的基因上调，涉及碳源同化、能量产生和糖酵解相关途径的基因下调。这些结果表明，突变菌株核黄素产量的增加与碳代谢通量从β-氧化途径向核黄素生物合成途径的转变有关。

(2) 细菌

核黄素在革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌中的生物合成已被详细研究，特别是在枯草芽孢杆菌和大肠杆菌中。在产生核黄素的细菌中，核黄素的合成是由编码五个基因的核黄素操纵子（rib ）控制的（图4）。然而，肋操纵子上编码核黄素合酶的前四个结构基因的顺序与核黄素生物合成途径中酶促反应的顺序不同（图3）。 RibA 是第三个 rib 基因，编码具有 GTP 环化水解酶 II 和 3,4-二羟基丁酮磷酸合成酶活性的双功能酶。该酶是一种限速酶，其 GTP 环化水解酶 II 活性催化核黄素合成中的第一个酶促反应。 RibG是第一个rib基因，编码另一种双功能酶，其核黄素特异性脱氨酶/还原酶活性可以依次催化第二步和第三步酶促反应。 RibH 是最后一个 rib 基因，编码二氧代四胺合酶（或核黄素合酶的 β 亚基），催化酶促反应的倒数第二步。 ribB基因作为rib操纵子的第二个基因，编码核黄素合酶的α亚基，催化最终的酶促反应。此外，rib操纵子还编码一个基因ribT，其功能尚不清楚。该基因被注释为编码一种推定的N-乙酰转移酶，研究表明，虽然该酶的失活不会导致核黄素营养缺陷型，但会显着减少核黄素的产生。最新的结构研究表明，枯草芽孢杆菌ribT基因编码的酶属于GCN5(-5)相关的N-乙酰转移酶(GCN5-N-，GNAT)超家族。该超家族的酶可以催化多种底物。物质的酰化反应是将乙酰辅酶A的乙酰基转移到底物上。

图 4. 细菌肋操纵子的结构。结构基因编码代谢相关蛋白，转运基因ribT编码转运相关蛋白。细箭头表示从启动子 P1、P2 和 P3 开始的转录方向。这里，RFN指RFN，即RFN元件。

ribC、ribR和ribO是存在于枯草芽孢杆菌rib操纵子上游的三个调节区，被认为是核黄素生物合成的假定抑制剂，因为每个区域的突变都会导致核黄素的过度合成。其中，ribC和ribR分别编码双功能黄素激酶/FAD合酶和单功能黄素激酶。这两种酶可以依次将核黄素转化为FMN和FAD。 RibO是位于ribP1启动子和ribG基因之间的非编码区，其转录物可以折叠形成保守的RNA二级结构，称为黄素单核苷酸核糖开关（FMN）。黄素与 FMN 核糖开关的相互作用在 rib 操纵子的转录调控中起着关键作用。在解离状态下，FMN浓度太低，无法与FMN核糖开关结合形成抗抗终止子结构，从而形成抗终止子，保证后续基因序列的转录；然而，在抑制状态下，FMN与FMN核糖开关结合形成转录终止子来终止转录。

此外，如图4所示，rib操纵子还含有三个启动子，包括一个初级启动子P1（ribP1）和两个次级启动子P2和P3（ribP2和ribP3）。 ribP1启动子位于第一个结构基因ribG的上游，ribP2启动子位于ribB的编码区，ribP3启动子位于ribH和ribT基因之间。四个 rib 基因 ( ) 的转录主要由 ribP1 和位于 rib 操纵子 5' 端的调控区控制。最后两个基因 ribA 和 ribH 的转录由 ribP2 启动子和 RFN 调节区控制。

1.丙酮丁醇梭菌

乙梭状芽孢杆菌（，C。）是一种严格的厌氧革兰氏阳性细菌，已广泛用于生物丁醇的发酵生产已有一个多世纪。该细菌通常以平均质量比为6：3：1合成丁醇，丙酮和乙醇。自1940年代以来，除了作为高丁醇产生菌株的作用外，该细菌作为天然核黄素产生菌株的作用也因其丁醇 - 丙酮 - 乙醇（ - ABE）发酵过程而被认可。发现了核黄素的存在。从经济的角度来看，如果核黄素作为第二种产品的工业产量或高价值副产品的工业产量可以达到0.5〜1.0 g·L-1，则ABE发酵过程的经济价值将得到显着提高。然而，经过数十年的研究，乙乳tri裂abe发酵期间的核黄素产生仍未得到充分改善。最近，赵等人。发现使用木糖作为碳源在细菌生长培养基中的外源添加乙酸钠（NAAC）作为碳源在ABE发酵时对核黄素合成的促进作用很强。添加60 mol·L-1 NaAc后，核黄素的生物合成速率（RIBA通量率）几乎是对照组的10倍，核黄素的最终浓度也从初始不可检测到0.2 g·L-1（ 0.53 mmol·l-1）。这项研究为基于乙梭状芽孢杆菌的生物丁醇和核黄素的发酵共生产提供了一种新的策略。该策略的实施将改善安倍晋三发酵过程的商业价值。

2.大肠杆菌

作为用于基本生物学研究的常用工具菌株，革兰氏阴性细菌大肠杆菌（大肠杆菌）的基因组已得到很好的特征，并且还构建了各种适合其基因编辑的成熟分子工具。此外，由于其许多优势，大肠杆菌长期以来一直被用作有效合成各种物质的常见宿主，例如氨基酸，生物燃料和散装化学物质。例如，大肠杆菌在最佳培养条件下迅速生长，只有20分钟的两倍时间，并且在由廉价的原材料组成的媒体中很容易生长。基于这些有吸引力的优势，大肠杆菌也被认为是核黄素生产的潜在有效宿主。但是，在自然条件下，野生型大肠杆菌无法累积核黄素。因此，已经进行了一系列关于核黄素产生大肠杆菌菌株的研究，并探讨了大量的代谢工程策略。

目前，几乎所有实验室大肠杆菌菌株均来自非对照的K-12或B菌株。尽管这两种菌株之间的细胞代谢和生理学存在许多差异，但比较基因组分析表明它们非常相似且密切相关。与K-12菌株相比，B菌株在最小培养基中生长得更快，重组蛋白的表达水平较高，乙酸产生较低。大肠杆菌BL21（DE3）是一种特殊的工程B菌株，在科学研究和工业生产中最广泛使用。阐明K-12和B菌株之间的调节机制和代谢差异的差异将有助于改善其在代谢工程中的利用。

王等人。首次证明大肠杆菌BL21（DE3）可以在正常培养条件下积累核黄素。与核黄素生物合成有关的酶的序列分析发现，与K-12菌株相比，BL21（DE3）菌株在RIBF基因的第115个氨基酸残基处具有单点突变。该突变导致RIBF基因编码双功能核黄素激酶/FMN腺苷转移酶的活性不足可能是核黄素在该菌株中的积累。然而，进一步的定量PCR分析表明，所有核黄素生物合成基因均上调，表明过度的核黄素积累也可能是由一种调节机制引起的，该机制上调了所有核黄素生物合成基因，并且这一原因似乎更合理。这项研究表明，大肠杆菌BL21（DE3）也可用于核黄素产生。

研究表明，枯草芽孢杆菌的嘌呤生物合成途径中某些关键基因的修饰可以增加核黄素前体的供应，从而促进核黄素生物合成。近年来，在大肠杆菌中也进行了类似的研究工作。徐等人。首先使用野生型大肠杆菌作为起始菌株首次构建了产生核黄素的大肠杆菌RF01，然后使用重组菌株的肋骨基因和途径的五个关键基因（包括NDK，GMK，GMK，Pura，Pura，Pura，Pura，Pura分别修改了PRS），最后是菌株RF18，可以同时获得所有六个基因。摇瓶发酵中这种菌株的核黄素产生为387.6 mg·L-1，核黄素的转化率为44.8 mg·G-1葡萄糖。与RF01相比，核黄素产量和RF18S的转化率分别增加了72.2％和55.6％。这项研究证明，使用合理的代谢工程技术同时修改DHBP合酶和GTP生物合成途径是一种有效的策略，可以显着增加大肠杆菌中核黄素的产生。

林等人。使用代谢工程技术来构建带有核黄素操纵子（由诱导型TRC启动子调节）的质粒P20C-EC10，并将其转换为野生型大肠杆菌。所得的重组菌株RF01s可以累积229.1 mg l-1核黄素。随后，PGI（编码葡萄糖-6-磷酸异构酶），EDD（编码磷酸葡萄糖酸脱氢酶）和EDA和RF01S菌株的EDA（编码多功能2-酮-3-脱氧乙酸氨基酸氨酸酯酶）是 /2-磷酸氨基酶是 /2-酮-4-H-4-H-，逐渐删除醛糖酶/草乙酸脱羧酶）基因，并将TRC启动子插入其ACS基因（编码乙酰-COA合酶）上游以获得重组菌株RF05S。它的核黄素产量可以达到585 mg∙l-1。最后，通过调节RIBF基因（编码双功能核黄素激酶/FMN ）在RF05S菌株中的表达，以减少核黄素向FMN的转化，因此在37条件下构建了这样构建的菌株RF05S-M40，在37个条件下构建了℃条件，1036 mg，1036 mg gr。 ∙L-1核黄素可以在Lb（Luria-）培养基中产生。在优化发酵条件后，在最佳条件下通过摇烧烧瓶发酵的RF05S-M40应变的核黄素产生达到2703 mg l-1，比RF01S菌株的核黄素产生的近12倍。核黄素转化率为136 mg∙g-1葡萄糖。在奶昔发酵下，大肠杆菌RF05S-M40的核黄素产生是所有报道的核黄素产生菌株中最高的。随后，Lin等人的实验室。还使用野生型大肠杆菌作为起始菌株，通过击倒PFKA（编码6-磷酸葡萄糖酸乳酸酯I），EDD和EDA基因来增加戊糖磷酸盐（PP）。通过途径的碳代谢通量，成功构建了另一种新的核黄素大肠杆菌菌株LS02T。该菌株携带的核黄素操纵子表达质粒PLS01在这项研究中也是新构建的，它的稳定性比上述研究中构建的质粒P20C-EC10更好。通过奶昔发酵，这种菌株可以在含有10 g l-1葡萄糖的MSY培养基中产生核黄素667 mg l-1。在饲料批次发酵中，该菌株的核黄素产生达到10.4 g l-1，转化率为56.8 mg g-1葡萄糖。这项研究首次报道了核黄素产量的工程大肠杆菌菌株在喂养批次发酵中超过10 g l-1。以上两个研究结果表明，大肠杆菌确实是一种潜在且有效的核黄素产生菌株。

3。枯草芽孢杆菌

芽孢杆菌（B.）是一种天然常见的细菌，它是所有克阳性细菌中最明显的细菌之一。它已被欧洲食品安全管理局（Food，efsa）授予安全资格识别（OF，QPS），可用于生产动物饲料，人类食品和补品，例如维生素K2，这是一种安全稳定的细菌的产生。此外，基于生物化学，生理和遗传水平中核黄素生物合成酶的详细研究，芽孢杆菌也已成功地转化为核叶酸纤维蛋白产生的细胞工厂。因此，芽孢杆菌已成为核叶黄素商业化细菌的首选，目前也是最重要的细菌。

在过去的20年中，研究人员在代谢工程技术的帮助下，对代谢工程技术中核苷生产的改善进行了大量研究。这些研究大多数集中在制备供应和关键酶的控制上。这两个点也被认为是核黄素合成的主要限制。

5-核酸（-5-，RU5P）是核蛋白的最初体体性物质，它合成了磷酸糖原性糖原的氧化分支。 6-磷酸葡萄糖脱氢酶（-6-，G6PD）和6-磷酸脱氢酶（6-，6GPD）。但是，这两种酶的活性将被RU5P和其他几种细胞代谢物（如NADPH和1,6-磷酸盐（-1,6-，FBP））抑制。这种细胞内代谢产物的变性抑制作用会导致核黄素合成所需的前体材料供应不足。王等人。克隆ZWF（编码G6PD）和GND（编码的6GPD）基因的细胞杆菌，并成功地消除了具有固定点突变的这两个基因的反馈抑制，以通过遗传修饰提高RU5P的利用率。随后，将这两个突变碱基进口到B. Rh33菌株中，用于单独的表达或共同表达，以量化其对核黄素合成的合成的影响。结果表明，与基于Pro的菌株RH33相比，工程菌株中代谢产物合成中代谢产物的含量显着增加，例如RU5P（46％），DMRL，氨基咪唑和。在瓶装的发酵中，工程菌株B. SVZ（ZWF基因的单独表达），工程菌株B. SVG（单独表达的GND基因）和工程菌株B. VGZ（ZWF和GND基因的共同表达）分别增加了。 18％，22％和31％。在进一步的补充中，B。VGZ的核苷产量平均增加了39％。该研究证明，pre -tody材料的供应是雄杆菌菌属合成合成的主要限制，以及使用代谢工程技术将碳代谢通量重新定向到磷酸五角酸五角牙途径是提高产量的有效策略核黄素。

为了增加核叶酸叶黄素生物合成的碳代谢通量水平，生成了核B的shi和其他肋骨算子BS77菌株，包括Riba基因的表达，原始的启动子RIBP1替代（用强推替换） - B. 168菌株的 P43和RFN调节区域的Ribo基因的敲除。其中，由RIBA基因表达的BS89具有最高的核叶黄素产生（506 mg l-1），是BS77菌株（210 mg l-1）的1.4倍。在此基础上，然后制定一个连续的优化计划，以减轻BS89应变肋骨操纵嘌呤生物合成途径的反馈调节，其中包括：①敲除粉推嘌呤操纵剂（Purr，Purr，由Purr Gene编码）基因和5' - 端5' - 端非端 - 翻译区（5'-，5'-UTR），其中包含代码核的核糖开关，以消除反馈抑制； ②通过定点突变对PRPP转氨酶（由Purf基因编码）的产物的产物反馈抑制。这些遗传修饰成功地实现了嘌呤生物学合成的代谢通量的增加，因此在摇动瓶装发酵条件下，构建的基因工程细菌BS110（Purf-VQW突变发生）（Purf-VQW突变发生），获得最高的核蛋白输出（827 mg ∙ll这些l -1）。研究表明，通过合理解除嘌呤生物合成途径的反馈调节，消除了转录抑制和产品反馈抑制，这是提高代谢产物产量的可行策略。

为了制定合理且改进的代谢工程策略，以改善目标炼金术的产出，因此必须了解对中央碳代谢方法的深入了解。糖原（，GNG）是指将非硫糖物质转化为葡萄糖的生物学过程，这是中央碳代谢的最重要方法之一。糖原途径的调节已成功地应用于谷氨酸滚子的碳代谢通量的重定向。此外，前任表明，糖原途径中关键酶反馈调节的提升也是一种可行的策略，可以进一步改善核苷酸的输出。

因此，王等人。将B. rh33作为起始菌株，通过菌株中表达的三个关键糖异质基因，包括GAPB（编码NADPH依赖性的3-磷酸脱氢酶），PCKA（编码磷酸磷酸盐，编码磷酸盐编码磷酸盐）和FBP（编码果糖-1,6 -Di磷酸酶）基因，系统地研究了糖原反馈调节的核苷产量增加的增加的影响。结果表明，与RH33菌株相比，GAPB和FBP基因在瓶中发酵中过表达的基因工程菌株的核苷酸产率显着增加，达到了最高的4.89 g l-1，而核素的产生增加增加了。 21.9％及其在降解中的核苷酸产量增加了27.8％。这项研究表明，糖原途径缓解的反馈调节是进一步提高甲板黄体黄体蛋白产量的有效策略，并且该策略也适用于PP途径中代谢物的其他直接合成，也适用于PP途径的合成。其他直接合成的合成自我 - 合成。需要NADPH和葡萄糖作为碳源物质。

张等人。 RIBA和RIBH基因修饰的作用对芽孢杆菌杆菌的吉林产量产生了影响。结果表明，与RIBA基因的单独表达相比，与脱离菌株LXZ-1相比，工程细菌LXZ-2增加了99％。 1。但是，工程真菌的生物量降低了30％，由于5-氨基-6-（1-D-核糖醇amin amin amino）的积累，细胞的积累被自解溶。与菌株LXZ-1和LXZ-2相比，RIBA和RIBH基因在工程细菌LXZ-3中表达了它们的组成部分，从而使其核营养量的输出增加了280％和91％，并且没有生物量减少，细胞也有所减少和细胞。自我拆卸现象。随后，Zhang等人。将带有完整的肋骨操纵器的低拷贝数（PMX45）转换为菌株LXZ-3，获得了LXZ-3/PMX45菌株，并将其用于不同的碳源（包括葡萄糖，蔗糖，蔗糖，蔗糖，影响对影响的影响对影响的影响核黄素在不同比例的木糖和蔗糖混合物中的多比例的合成中发现，当使用率为1.5：6.5时，蔗糖和木糖混合物（总糖增加了8％，W/V）来源，应变LXZ-3/PMX45是发酵瓶后的核黄色。 g∙l -1。

Novis（NTC）是一种可以抑制蛋白生物基的链霉素抗生素，该蛋白质被广泛用于细菌，真菌，酵母菌和植物细胞的抗筛分中。程等人。首先，遗传工程技术将SAT基因（编码链蛋白酶编码）插入表达质粒PMA5中，并构建了一种新型的NTC抗性。 （编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，G6PD和核苷生物合成的关键酶之一）整合到重组耐药性颗粒中以获得重新组织的质粒PMA5-SAT-SAT-ZWF。最后，将重组的质粒转化为菌株B。RF1，以研究ZWF基因到期对核苷合成影响的影响。结果表明，与原始菌株B相比，重组B. RF1-PMA5-SAT-ZWF的G6DP活性增加了50倍，表明G6PD成功。 5升发酵罐中重组应变的最终核黄体输出达到12.01 g l-1，比RF1菌株增加了30.3％。这些结果表明，新建的抗NTC抗颗粒PMA5-SAT在核鲁ut脱石孢子的遗传修饰中具有潜在的应用值。

此外，根据报道，源自dawo链霉菌（）的RIBM是KWO芽孢杆菌中的一种非能量依赖性的功能性核素转移，主要促进核黄素的外排。将DAWO链肌肉型的RIBM基因转换为可以有效产生核苷蛋白的脱落细菌，而所获得的RIBM高度表达了重组菌株的核苷输出，并且改善程度主要取决于感应性剂碱基。 -β-D-硫硫硫糖苷的量（β-D-，IPTG）。这是基于衍生物核鲁裂核苷产量的优化的第一个成功案例，这表明它是增加核黄素外部排放的有效策略之一，也是增加衍生菌细菌产量的有效策略。

除代谢工程方法外，发酵条件的优化也是提高衍生物核叶黄素产量的可行方法。

培养基的溶解度是发酵过程中最重要的参数之一，该参数与细胞的生长和产物的合成密切相关。因此，溶解氧的浓度是芽孢杆菌中核苷合成合成的关键因素，并且可以通过搅拌速度的变化轻松实现其改善。 Man等。研究混合速度对重组工程细菌的重组的影响B.RF1核病产生。动态分析结果表明，在发酵的早期阶段，较低的搅拌速度（600 r·min-1）可以促进细胞的生长和核黄素的合成，稍后需要晚期搅拌速度（900 r·min-- 1）。在此基础上，人类和其他人制定了两阶段的控制策略，即，在发酵的前26小时，搅拌速度设置为600R。发酵的末端。在整个发酵过程中，保持更高的细胞生长和核苷产量。但是，在第二阶段控制策略中搅拌速度的突然切换将对细胞的生长产生负面影响和核黄素在短时间内的合成。因此，Man等。随后，建立了一种从600 R. min-1到900 R. min-1的新策略。在这种策略下，发酵的核苷输出48 h达到了最高的9.4 g l-1，转化率为0.051 g g-1 g-1葡萄糖。与单个混合速度（600 r·min-1）复杂性的最佳结果相比，核黄素的产率和转化率分别增加了20.5％和21.4％。

为了找到合适的核苷蛋白合成促进剂，Wan等人。将细菌密度（OD600）和核黄素输出作为评估指标，将7种添加剂分别添加到瓶装发酵发酵时黄色的核。输出的影响包括钙葡萄糖，柠檬酸，柠檬酸钠，氯化钙，丙氨酸，苹果酸和1,6-二磷酸糖果（FDP）。该研究的结果表明，钙葡萄糖，柠檬酸钠和丙氨酸的核苷酸输出增加的增加是最重要的。因此，对这三种添加剂进行了筛选，以进行进一步的正交测试，以研究其对核黄素合成的全面影响。结果表明，当钙葡萄糖，柠檬酸钠和丙氨酸是7.5 g l-1，5 g l-1，1.5 g l-1的最佳浓度比，最高的尤金产量达到最高6.46 g 6 L-1，比没有添加剂时高约40％。

在最近的一项研究中，Oraei等人。评估了13种不同的矿物质[CACL2，CUCL2，FECL3，FESO4，ALCL3，CO（NO3）2。NACL，MGSO4，ZNSO4，MNSO4，MNSO4，MNSO4，MNSO4]对ATCC 6051菌株在瓶子发酵发酵中的影响旨在开发适当的发酵培养基以增加核苷酸输出。该研究首先是通过（PB）设计方法对核黄素合成产生重大影响的。结果表明，MGSO4和FESO4的浓度对核苷的合成具有最大的影响。随后，使用优化测试用于使用响应表面方法（，RSM）来确定筛选的五个培养基组件的最佳浓度（g∙l-1），包括所有测试中使用的两个碳源（果糖和果糖和酵母提取物）以及三个矿物质（MGSO4和FESO4）。当这5个成分的浓度为38.10 g l-1，4.37 g l-1，0.85 g l-1，2.27 g l-1和0.02 g l-1时，发酵瓶发酵72 H（11.73 G H L-1）后产量。

4。乳酸菌

酸（酸，实验室）是一种非杂货，非呼吸且通常非运动革兰氏阳性细菌或细菌的一种。乳酸是其糖发酵的主要或独特产物。这种细菌与人类的生活密切相关。由乳酸细菌及其产生的抗菌物质产生的酸性环境可以抑制发酵食品中许多损伤细菌和致病细菌的生长。自远古时代以来，乳酸细菌已成为发酵剂，并用于增强食物的生物保存。如今，乳酸细菌被合理地用作全球食品工业中的乳酸发酵剂，主要用于生产各种发酵乳制品（例如酸奶和奶酪），发酵香肠和泡菜（发酵蔬菜）。

尽管乳酸细菌通常是多种维生素营养缺损菌株，但众所周知，某些乳酸细菌可以合成某些B维生素，例如叶酸（或维生素B9），核黄素（或维生素B2）和钴胺（维生素B2）（维生素B2）（维生素B2）（维生素） B12）。乳酸细菌的维生素合成能力与不同菌株（即细菌或菌株的特异性）完全不同，这通常与缺乏维生素生物合成信息（部分或全部）有关。例如，筛选了使用基于PCR的技术在60个乳酸杆菌中使用核黄素生物合成基因筛选菌株的菌株，并且在此基础上，使用微生物实验来筛选具有核酸核酸核酸核酸酯合成功能的菌株。终于发现，非核叶黄素中只有14个菌株可以生长。基于上述结果的进一步全面分析表明，在不同类型的乳杆菌中，肋骨操纵剂的存在具有应变特异性，并且缺乏或不完全的乳酸菌肋骨肋骨手法通常与核蛋白酶生产能力的丧失有关。一起。根据以前的和以前的报道，植物WCFS1菌株含有不完整的肋骨操纵器。所有RIBG基因和一些RIBB基因都缺失。生长。但是，还有一些报道说，一些野生型陶器吡咯杆菌含有完整的肋骨操纵剂，可以产生核蛋白。例如，与传统的中国酱汁汁分离的L. ryg-gyy-9049菌株与泡菜分开。 L. NCDO 1752和L.，与天然酸面团分开。通常，乳酸菌肋骨操纵的完整性对于核黄素的合成至关重要。

鉴于其对人类健康的重要性和缺乏的普遍性，核黄素已成为乳酸细菌和研究最多的维生素之一。尽管核黄素通常存在于各种食物中，但由于饮食不平衡，世界上核素缺乏症的发生率仍然很高。在这种情况下，核苷生物学增强的食物吸引了人们的广泛关注，因为它们代表了一种更自然，更适合消费者，并且化学合成核的价格较低，这可以满足消费者对天然食品不断增长的需求。乳酸细菌对食品工业发酵及其核黄素生产能力的适应能力使它们成为生产食品核素的理想候选细菌，为开发富含核蛋白的新功能性食品提供了新的机会。因此，从各种食物来源筛查野生型素乳酸细菌引起了许多研究人员的兴趣。较早的报道说，从各种食物中获得了179种乳酸细菌，但在非核叶酸酯中只能生长42种菌株。基于这些菌株产生的核苷酸浓度（高效液相色谱法），最终筛选并应用于大豆牛奶发酵评估，5种具有高核叶酸脂蛋白生产能力的菌株（细胞外叶黄素浓度为190〜260 ng∙mml-1）最终筛选它们在该食物基质中的生长和核素合成能力。结果表明，在37°C下发酵12小时后，仅L. CRL 725菌株产生的核叶黄素浓度从最初的309 ng∙ml-1到700ng∙ml-1显着增加。在另一项研究中，总共分离了179种野生乳酸细菌，与生羊奶和奶酪筛查野生二氧化乳酸菌细菌的筛查。产生的核苷酸浓度为173〜532ng∙ml-1。

但是，当使用从食物或其他来源获得发酵生产的野生乳酸菌时，核黄素的产率和转化率相对较低，因为某些特定的生物学活性物质（例如核黄素）相对较低。最大产量不是他们自然优化的目标。因此，提高这些菌株的核叶黄素生产能以获得高产量仍然是一个挑战。为了实现这一目标，有两种类型的策略，即筛查玫瑰蛋白抗性菌株以及基于代谢工程的重组菌株的构建。

Rose （）是FMN和核黄素的天然有毒类似物，可以直接与FMN Ribon开关合并，该开关抑制了肋骨操纵提交的转录。在这种抗菌物质中暴露的可能会引起核苷乳酸细菌的自发突变，该突变会产生高 - 叶高 - 近代菌株。该策略已成功地用于筛选食品级菌株，例如芽孢杆菌，乳酸杆菌，乳酸杆菌，贫瘠的（）和（）和FAE计划。事实证明这是实用的。

P. nizo B2336是一种自发性抗透明丽丝蛋白突变体，它筛选了自我尺寸的P. Nizo B374菌株。它的核素输出高于原始应变。当将这两种菌株用作辅助发酵剂（将额外时间添加到酸奶发酵剂24小时）时，发现发现酸奶发酵试验是，酸性发酵测试是由P酸奶中核素的最终含量由P产生的酸奶。 。它是19.7μg，G-1，高于未与辅助发酵剂一起添加的酸奶（12.9μg∙g-1），酸奶（10.5μgg-g-1）用辅助发酵P. Nizo添加B374。这项研究证实，P. nizo B2336菌株可用于开发富含核苷的新发酵牛奶产品，而新产品可能会带来更多的健康益处。

如上所述，Del Valle和其他人选择了具有较高核黄素生产能力的L. CRL 725菌株。借助发酵的大豆牛奶，核叶黄素的浓度可以增加到初始浓度的两倍。它是在菌株抗罗斯叶黄素突变体的进一步筛选中发现的。发现其中一个突变体（称为CRL 2130）可以以初始浓度的6倍（从309 ng∙ml-1到1860 ng L ML-1）增加发酵大豆的浓度。这项研究表明，具有玫瑰碱耐药性的菌株可用于开发具有更高营养价值且核心丰富的新大豆产品。

另外，Russo等人。将野生型核和黄体发酵乳杆菌（命名）与酸面团分开，然后筛选其抗透射突变体。结果表明，在获得的15种因变体中，七个干扰变体的核苷输出超过1 mg l-1。其中，一个突变体（名为L..5）是最高输出（1.203 mg·L-1）的突变体，进一步用于添加带有商业酿酒（）（）的发酵面包，以增加增加面包的营养。与传统面包相比，通过发酵面包获得的核苷酸含量增加了约两倍，达到6.66μg∙g-1。最近，我们从传统的中国酱汁中成功筛选了天然核。其高产植物乳酸乳杆菌（称为RYG-YYG-9049），其核苷酸输出为0.734 mg l-1。随后，我们使用玫瑰蛋白诱导菌株的自发突变。 Among the anti- , No. 10 (named L. Ryg-YYG-9049-M10) was the . 。 When the is used for soy milk , the in the soy milk can reach 2.920 mg ∙ L-1 under .

to , the by the lack of the genes of the of the RIB and the of the base. , we have found a new type of in , that is, an of a DNA with a size of 1059 BP in the area of ​​the zone of the RIB . The main for the in yield. This shows that the by -proof can the of the and the of the , so that the RIB can to . , its exact still needs .

, the of acid / and the of are to the of in foods such as , and bread. The in in new foods can not only the value of food , but also bring to .

is used for the of with of . Wait for the 4 Ribg, Ribb, Riba, and RIBH RIB genes to into the in , and then the of the to the SSP. , to the RIB gene of The of plain . have found that only the L. and ( 4 RIB genes) have (24 mg ∙ L-1). As a , L., which is a , was into a .

By to rose , wait for a that is from L. to a - , and the of gene show that the L. CB010 only in the area of ​​the RIB gene 。变化。 , wait for the dual- gene of the amino-4--6- ----------- cavic acid folke to the to the and it to the L. CB010. It was found that when the Folke gene was in the ( the L. CB010) of the of the , the of folic acid also at the same time. , with the help of , folic acid and are at the same time as .

As a pre -body of and folic acid, GTP can be used by GTP ring II (coded by RIBA genes) for , and can also be used by GTP ring i (coded by FOLE genes) for Folic acid . , there is a for GTP these two , and the loss of FOLE genes may the of GTP, the of . L. MTCC 8711 is a wild -type from . Its is after the FOLE gene is lost. After 24 h in the CDM , the of the L. MTCC 8711 is 2.29 mg ∙ -1 L-1, and the can be to 72 h. After H, the was 3.49 mg ∙ L-1, which was about 50% than its pro-pro-mTCC 8711.

For to , has an and that uses no or only lower . , due to the of or for , has not been to food for .

4. 结论

This the of in years. It is in the of and the use of high -yield that from and . with all and semi - , the of is more and to in . In order to high -cost , in years, many based on and Ashu sac are . It has been to . , each has its own and , which is the most and can other , it is no . the of is low, with the agent, it is more for for food . Ferry -rich foods can not only the value and value of food , but also 's for . In , the of this new type of food is to the of . , the of with is used to open up a way for the of new foods for or (such as , , women, , , and ).