生物催化剂 2016 年 5 月 Universidada Industrial de Santander 的 Nazzoly Rueda 等人在 TCR 发表综述：Chemical Modification in the Design of Immobilized Enzyme Biocatalysts: Drawbacks and Opportunities

生物催化剂 2016 年 5 月 Universidada Industrial de Santander 的 Nazzoly Rueda 等人在 TCR 发表综述：Chemical Modification in the Design of Immobilized Enzyme Biocatalysts: Drawbacks and Opportunities

2016年5月，德国的Rueda等人发表了题为“in the of: and in TCR”的评论。

通讯作者：-

通讯作者：de álisis, ICP-CSIC C/Marie Curie 2, UAM-CSIC, , 28049 , 西班牙。

酶的化学修饰和固定化被认为是提高酶性能的两种不同方法。本综述介绍了如何将这两种工具结合使用，以大大提高生物催化剂的最终性能。修饰比游离酶的修饰更简单，也更容易控制。此外，如果对蛋白质进行修饰以提高其固定性（用活性基团丰富酶），固定化酶的最终性质可以得到大大改善。化学修饰不仅可以提高酶的稳定性，还可以增强选择性、特异性、活性，甚至细胞通透性。将固定化和化学修饰与定点诱变相结合是获得完全可控修饰的有力工具。已经提出了一些新的想法，例如可以在紫外光照射下改变其物理性质的光敏酶修饰剂。

01

介绍

酶是生物催化剂，能在生物体内进行多种反应。在环境友好的条件下，它们表现出很高的活性、选择性和专一性。大自然提供了各种各样具有不同特性的酶，它们能催化大多数已知的有机化学反应。它们甚至可以催化与自然反应截然不同的体外反应，例如，许多研究人员将水解酶用作合成酶或转移酶。此外，还发现了一些所谓的混合反应。在这些反应中，酶的催化活性完全独立于其自身的功能；在某些情况下，甚至不涉及实际的活性中心（例如，水解酶充当氧化酶）。因此，酶有潜力成为理想的绿色化学催化剂，能够在非常温和的条件下，以最高的原子经济性生产最复杂的化合物。

然而，酶在工业上的成功并没有像预期的那样高。这是因为酶具有生物起源；它们在数百万年的进化过程中被大自然选择以满足某些生理需求。因此，酶受到严格控制以应对环境条件的变化，而工业反应器中不会发生这种变化，研究人员在工业反应器中引入恒定浓度的明确底物，目的是实现完全转化为明确产品。因此，酶的稳定性通常在几小时到几天之间，而在工业中，稳定性应以月为单位（至少）。酶会受到酶所处的代谢途径中间体的影响（有时与大多数酶相同）是水溶性的，这意味着酶的回收和再利用可能不太容易。目标酶将与许多其他酶一起产生；这可能会降低最终的总体活性，或者如果某些杂质酶识别底物或产物，则可能会降低该过程的选择性或特异性。高特异性意味着目标酶与许多其他酶一起产生；这可能会降低最终的总体活性，或者如果某些杂质酶识别底物或产物，则可能会降低该过程的选择性或特异性。在此过程中，将底物交换为非常相似的底物可能需要找到另一种识别新底物的新酶。高选择性意味着只获得一种产品，但如果研究人员想要获得另一种产品，在大多数情况下需要开发一种新的酶生物催化剂。使用天然底物发现酶的高活性，但有时有趣的化合物不同，观察到的活性要低得多。因此尽管酶具有巨大的潜力，但其在工业上的影响仍然有限。

幸运的是，如今有许多不同的工具可用于改善酶的性质。宏基因组学等微生物学工具提供了大量新的酶，其中一些来源不明，但具有新的和有趣的特性。进化极大地改善了酶的性质以解决特定问题（在特定介质中的稳定性或活性，相对于底物的活性）。因此，化学修饰或固定化等旧技术显然在工业生物催化剂的制备中失去了意义。

然而，大多数酶需要以固定化形式使用，以解决酶在水中溶解度的问题。这意味着固定化不是生物催化设计中的额外步骤，而是一个必要的步骤。在此前提下，许多研究人员致力于将固定化与解决其他酶限制问题相结合。因此，如果固定化针对特定的酶特性，则可以实现酶纯化，有时固定化和靶向诱变可以结合起来。固定化还可以提高酶的稳定性，无论是在多个位点、多个亚基，还是在有利的环境中。虽然不太可预测，但也有一些相关的例子，其中固定化可能提高酶对特定底物的活性，更有趣的是，由于稳定​​性增加或酶构象变形，酶的特异性或选择性可能得到改善。最近的研究表明，一些酶可以通过添加剂稳定，但只有按照特定方案固定时才稳定，而相同酶的其他固定化制剂在这种药剂存在下保持稳定。在很多情况下这些结果并不容易解释，而且由于确定固定化酶结构存在问题，对于遗传工具不被认可的解释是经验性的，但这并不排除在很多情况下固定化可能带来令人印象深刻的稳定化因素、酶特异性逆转等，而且重要的是它与所有其他稳定化策略兼容。另一方面，化学修饰在确定某些基团在酶催化中的作用方面非常重要。然而化学修饰也被用于改善酶的性质，在文献中可以找到一些例子。与遗传修饰相比，化学修饰有两个主要问题：首先，很难实现完全的修饰可控（除非与定点诱变相结合），需要在每一批生物催化剂中进行。作为一个主要优点，可以说它是在已经折叠的酶中进行的，从而克服了修饰影响蛋白质的可能性。此外，即使酶的结构未知，也可以确保只对外部基团进行修饰。此外，基团的类型不仅限于氨基酸；引入基团的性质和类型仅受研究人员想象力的限制。

使用游离酶时，由于酶与化学修饰剂分离困难，化学修饰可能难以控制；存在共价酶聚集（使用双功能试剂）或蛋白质表面性质改变导致蛋白质沉淀的风险。使用先前固定化的酶可大大简化此过程。如果酶不能重新沉淀，则可通过改变载体负载和/或固定化速率来控制共价蛋白质聚集的可能性。反应更容易控制，反应速率更快；过滤足以停止反应。此外，在某些情况下，使用通过不同因素稳定的固定化酶可提供更耐化学修饰并维持更高活性水平的酶。

在这里，我们重点关注化学修饰和固定化的结合（修饰酶以改善其固定化，或修饰固定化酶以改善其性能）。这个主题之前已经进行了综述。因此，我们打算更新这篇综述，并概述固定化生物催化剂设计中的化学修饰。

02

内容

1. 酶化学修饰的目的

通过化学修饰酶来提​​高生物催化剂的最终性能所追求的目标可以概括为三类：促进交联、全面改变酶表面的物理特性或修饰关键功能基团。

1.1. 促进交联

交联的第一个目的是通过促进蛋白质不同功能基团之间的化学键来提高酶的稳定性。交联可以是分子内的、亚基间的（对于聚合酶或多酶系统）或分子间的。（例如，将其用作固定化方法，例如交联酶、交联酶晶体或交联酶聚集体 (CLEA)，或先前固定化的酶的交联层；图 1）。

图 1. 蛋白质不同功能团之间的化学键促进：分子内、亚基间和分子间交联。

1.1.1. 分子内交联

在分子内交联的情况下，参与反应的基团在暴露于任何使酶变形的条件（热、溶剂、离液剂等）时，应该保持它们的相对位置（它们的相对移动性仅是间隔臂长度的函数）。聚合物也可以涂覆在酶表面，这涉及到蛋白质表面的大量基团，但由于它们的柔性，引入蛋白质结构的刚性可能不是十分显著。事实上，在某些情况下，修饰酶的最终稳定性低于未修饰酶。然而，聚合物可能有其他积极作用（例如，改变酶的微环境以促进失活化合物如有机溶剂或过氧化氢的分离），同时不发生严重的扩散限制（图2）。

图 2. 用聚合物涂覆酶表面以调整酶的微环境。

双功能试剂最先实现了这一目标，至今仍常用于创建交联。然而，它们也有一些局限性。首先，蛋白质中反应基团之间的距离必须等于或小于交联试剂中活性基团之间的距离。其次，当使用同功能交联剂时，单点修饰（非常快）和交联（慢得多）之间的竞争会使结果的解释变得复杂（图 3）。一些试剂（如戊二醛和甲醛）可能会与自身发生反应，从而减少这种竞争，因此它们已成为最常用的交联试剂。然而，对于非常激烈的分子内交联，由于对尺寸的要求很高，使用小的双功能试剂可能会相当复杂。在某些情况下，事先用反应基团富集酶表面是提高交联步骤成功率的有效方法。

图3.交联剂长度与促进酶表面单点修饰或分子内交联的相关性。

1.1.2. 亚基间交联

在某些情况下，亚基解离可能是聚合酶失活的第一步（图4）。但是，如果某些酶亚基没有附着在支持物上，则有可能酶会污染介质，从而降低酶的活性。这会影响固定化的效果（图4）。交联是解决此问题的有效方法，与分子内亚基的情况一样，可以使用多种交联试剂。

图 4. 通过亚基解离或释放未完全附着在固定载体上的固定化聚合酶亚基使聚合酶失活。

如果酶的所有亚基都在一个平面上，那么使用载体作为交联剂可以解决亚基解离的问题；有策略可以强制固定涉及最大数量酶亚基的酶（图 5）。如果酶是平面的（例如四面体），由于几何原因，这显然行不通。如果可以使用这种策略，进一步加强酶的共价多点附着可能会大大提高酶的整体稳定性。

图 5.固定多个亚基来解决酶解离问题。

目前还没有关于使用小纳米粒子的报道，但这种方法应该是可行的，因为它可以涉及整个酶结构，而不管酶的几何形状如何（图6）。聚合物已被用于物理或共价结合防止酶亚基解离；它们的大尺寸已被证明对于稳定聚合酶非常有用，尽管它们可能不会导致酶刚性化（图7）。醛基葡聚糖能够稳定粗蛋白溶液中的任何聚合物。此外，用聚合物（醛基葡聚糖、聚乙烯亚胺（PEI））处理的酶在与疏水相互作用（如气泡）的相互作用中也能得到稳定；因此，这种处理具有双重积极作用。

图 6. 通过在表面涂覆活性纳米粒子来稳定聚合酶。

图 7. 通过在聚合酶表面涂覆多功能聚合物来稳定聚合酶。

用小的双功能试剂完全稳定聚合酶比通过交联稳定单体酶更困难，因为基团需要以适当的距离位于不同的亚基上，并且每个酶亚基必须至少引入一个交联才能实现真正稳定整个聚合酶结构。不过，文献中也有一些成功的例子。

1.1.3. 分子间交联

分子间交联是一种获得在任何条件下都不溶解的固体酶衍生物的方法，是无载体固定化方法的基础。交联步骤是一个关键步骤，因为它有时会导致酶失活，因此必须正确选择，否则在其他情况下酶表面没有足够的基团参与交联。

戊二醛是最常用的化合物，它能与酶的赖氨酸基团形成聚合物。使用大分子聚合物作为交联剂可以防止这种试剂造成的酶失活，因为大分子聚合物（如葡萄糖醛酸苷）在空间上受到限制，不能接近酶的关键基团。此外，新的交联试剂也已被提出。酶表面缺乏活性基团和不能形成聚合物的问题已经通过使用进料源得到解决。这些可以是富含这些基团的蛋白质（例如白蛋白）或亲核聚合物（例如 PEI），它们也可以创造亲水纳米环境（图 8）。对酶表面进行化学胺化也是一种方法，它可以大大提高从存在此问题的酶制备 CLEA 的效率，而不会牺牲酶的体积负载。

图 8.获得低赖氨酸含量的 CLEA。

用交联剂处理吸附的蛋白质是提高吸附固定化酶稳定性的常用方法，因为这样还可以防止酶的解吸。最典型的例子是用戊二醛处理吸附在具有伯氨基的载体上的蛋白质酶。标准方案包括酶和载体的活化，这可能同时产生分子内和分子间的交联，以及酶和载体之间的反应。使用戊二醛活化的载体的主要目的是交联多个酶分子。这使酶从载体上的解吸变得更加复杂（整个酶组装体需要同时从载体上释放出来）。为了达到良好的结果，蛋白质分子必须足够接近以允许交联发生。使用聚合物可能很容易使用小试剂，需要将酶堆积在一起，这只有当固定化非常快时才能实现，快到酶在固定化之前无法扩散通过载体的孔隙。使用糖脂酶和戊二醛的研究清楚地表明，可以根据固定速度来控制分子间的交联；如果固定速度很快，就会产生大的聚集体，而如果固定速度很慢，共价聚集体的数量就会大大减少。

1.2. 酶表面物理和化学性质的整体修饰

在某些情况下，研究人员试图通过修改酶表面的物理性质来改善酶的性质。目标是改变酶表面相互作用的网络。这些变化可能会降低酶的活性和稳定性，但在某些情况下，这些整体变化会导致更好的生物催化剂，主要是脂肪酶。从这个意义上讲，疏水化、阳离子化或阴离子化是最常用的策略，而酶性质的改善包括更好的细胞通透性、更高的稳定性或活性（图9）。

图 9. 通过化学修饰酶表面来提高酶的性能。

在某些情况下，进行修饰只是为了改善酶的固定化；例如，增加反应基团的数量可以增加酶-载体键的数量（图 10），或者改变阳离子或阴离子基团可以使酶固定在某些载体上。在其他情况下，使用整体化学修饰以获得更容易与小的双功能试剂或载体交联，或者引入可能比蛋白质上的天然基团更具反应性的基团以进一步引入有趣的修饰，例如，用适体修饰蛋白质以改善抗体，同时还用第二个分子修饰酶表面。

图 10. 对酶表面进行化学改性以提高酶的固定化效果。

要实现酶表面性质的这种显著变化，最简单的方法就是使用聚合物，聚合物既可以简单地吸附在酶表面，也可以共价连接。如果是物理吸附，聚合物不会影响酶的化学结构。它能够与酶建立许多相互作用，从而将酶牢固地固定在蛋白质表面，并引起酶整体物理性质的显著变化。这种聚合物可能对酶链的运动造成一定的空间阻碍，如PEI用于维持洗涤剂诱导的磷脂酶的开放形式。聚乙二醇通常用于化学改性，使酶表面具有疏水性，从而增加酶在有机介质中的溶解度，也可用于调节酶的性质。

使用小分子试剂需要对酶进行共价修饰，因为物理吸附力太弱，无法在操作条件下维持酶-化合物复合物。这导致酶的化学修饰，其复杂性可能更高。我们确实改变了酶表面的性质，并可能通过离子排斥改变了许多离子桥。对修饰的控制可能会增加调整此策略的可能性；但是，只有均质修饰才会完全修饰或未修饰。如果酶具有某些特殊的活性基团（例如氨基末端或酶可能天然具有或可以通过基因工程引入的独特 Cys），那么在某一点上也是有可能是均质的。

1.3 酶表面关键基团的修饰

一些蛋白质可能具有与酶的稳定性、活性或选择性密切相关的关键基团。在某些情况下，对其中一些关键基团进行特定的修饰可能会极大地影响酶的性能。使用标准协议，只有当特定基团比其他基团反应性强得多时才有可能进行修饰，但研究人员可以全局地修饰蛋白质，并以这种方式修饰所需的基团。对其他基团的修饰可能会掩盖这种影响，但可能很难获得完全的位点特异性修饰。另一方面，通过对含有关键基团的特定氨基酸进行突变，也可以通过蛋白质工程实现对关键基团的修饰。

将定点诱变和化学修饰相结合，可以在蛋白质的特定区域引入基团、肽或聚合物，避免修饰蛋白质的其他基团。这种耦合可能允许非常有趣的方法，从而可以表征酶。例如，Cys 基团可用于通过硫醇二硫键将肽与脂肪酶的特定区域结合。

2. 固定化蛋白的改性

固定化和化学改性不应被视为并行的工具；在许多情况下，它们的结合使用可以提高生物催化剂的最终性能。事实上，正如本文前面所讨论的，与游离酶的修饰相比，固定化酶的化学修饰具有一些优势，主要是如果这些过程要大规模实施的话。事实上，即使酶最终以游离形式使用，也建议找到一些与要进行的修饰兼容的可逆固定化方法。兼容才能从固相的化学修饰中获益。要求是在修饰过程中，载体必须保持不变，酶必须保持固定；然后可以通过选择适当的条件将其解吸（图 11）。文献中发现的大多数例子都是通过界面活化将脂肪酶固定在辛基琼脂糖上。该载体仅具有少量羟基和辛基，​​不会干扰化学胺化、琥珀酰化、醛糖苷化或使用碳二亚胺的其他反应、聚糖或戊二醛修饰等。修饰后，可通过洗涤回收游离酶以供进一步使用（或进一步固定在不同的最终载体上）。

图 11. 可逆固定化酶的化学修饰。

2011年之前固定化酶化学改性的例子已经介绍完毕。下面我们重点介绍一下近期的例子。

通过界面活化法将来自的脂肪酶预先用醛基葡聚糖固定化，然后进行分子间交联，使酶可以在50% (v/v) 2-丙醇存在下水解沙丁鱼油，生成二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸和二十二碳六烯酸，从而防止酶从载体上解吸。戊二醛是一种非常有趣的化合物，在生物催化中用途广泛，近年来对其进行了综述。酶的风险之一是它们会促进分子间反应并产生不必要的酶聚集。可以通过在酶表面涂一层聚乙二醇 (PEG) 来防止酶与酶之间的相互作用，从而解决这一问题。然而，使用固定化酶可能是实现这一目标最简单的方法。我们的研究小组通过添加 30% (v/v) 乙醇来控制脂肪酶 B 在辛基琼脂糖上的固定化速率。放慢反应速度。

这样，就可以把分子间和分子内交联的作用区分开，而又具有不同的稳定性以及在洗涤剂或溶剂中的抗解吸性。还有许多其他对酶进行整体修饰以改善酶某些性质的例子。例如，将头孢菌素C酰化酶吸附到胺化载体上，用戊二醛处理，使酶与载体发生交联（最有可能引入分子间和分子内交联）。化学活化后，可以用PEI和壳聚糖进一步修饰酶。用PEI修饰的制剂的热稳定因子是游离酶的20倍，其KM（14.3 mM）低于未修饰制剂（33.4 mM）。新制剂的半衰期为28个循环，而戊二醛固定化酶的半衰期为21个循环。这些有利的酶特性可能有几个真正的原因，例如促进有利的环境、酶亚基、碱基的交联和蛋白质链运动的空间障碍。

在其他情况下，用离子聚合物对固定化酶进行物理涂层处理已被证明可以调整酶的特性。例如，在溴化氰琼脂糖（通过共价连接）和辛基琼脂糖（通过界面活化（在疏水支持物上的物理吸附））上固定化磷脂酶，用硫酸葡聚糖或PEI包被。一般来说，PEI包被可显著提高酶活性（对于某些底物可达30倍）和稳定性（在30％乙腈中可提高30倍）。另一方面，硫酸葡聚糖包被一般会对酶活性产生一些负面影响。这项工作的主要结论是，离子聚合物包被的影响在很大程度上取决于底物、实验条件和所用的固定化技术。后来，通过在十二烷基硫酸钠（SDS）存在下处理共价制剂，用PEI来稳定这种去污剂诱导的开放区域。在水缓冲液中用PEI包被固定化酶，与对硝基苯基丁酸酯（pNBP）相比，酶活性增加了三倍。但在0.1% SDS（v/v）存在下，涂层使酶活性提高了50倍，并且在去除洗涤剂后活性保持不变。脂肪酶。（组分B）、us和R.被固定在与上述相同的载体上。这些固定化酶的表面经过化学或物理改性（酶的羧基用乙二胺改性，氨基用琥珀酸酐改性）。​​这些处理可以改变酶在水解沙丁鱼油产生EPA和DOA时的活性和选择性。然而，改性的效果取决于固定化方案。和反应介质的pH值。

在其他情况下，引入的聚合物与酶仅具有一种共价相互作用，然后可能与酶具有一些其他相互作用（疏水相互作用，离子相互作用等）。 PEG是实现此目标的最广泛使用的分子之一，主要是因为它有助于增加酶在有机介质中的溶解度（以可溶形式）。 这种修饰的目的可能是完全改变酶的表面，在这种情况下，在酶表面引入许多聚合物分子很方便。 这些方法已经演变成更复杂的策略，涉及预先对固定化酶进行化学修饰以增加蛋白质表面的反应性。 酰亚胺途径用于使用琥珀酸酯-PEG修饰来自C. 的脂肪酶B（CALB）。 固定在辛基琼脂糖上的CALB的天然氨基的修饰不会显着改变CALB中的氨基。 而在初始化学胺化后，每个酶分子可以引入大约14-15个PEG分子。同样，修饰对功能特性的影响取决于固定化方案和基质。化学修饰的目的可能是使载体蛋白表面包覆感兴趣的分子，例如，诱导免疫原性反应或产生嵌合蛋白。最近，有人提出，脂肪酶可以固定在疏水性纳米颗粒上以实现此功能。固定化脂肪酶经过修饰后具有环氧官能团，可用于与其他分子反应。

酶表面整体修饰的例子有很多，在一定程度上提高了酶的性能。利用碳二亚胺的方法，用乙二胺修饰固定在辛基琼脂糖上的T.脂肪酶的羧基。通过控制碳二亚胺的浓度，对羧基进行不同程度的修饰。固定化酶经化学修饰后，其活性与胺化程度成正比增加，该酶的热稳定性比未修饰酶主要在pH 5时高（几乎提高了30倍）。在另一篇文章中，C.脂肪酶B.然后用乙二胺或2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）在单个反应中或连续使用几种修饰方法对酶进行进一步修饰。化学修饰对酶性质的影响在很大程度上取决于所用的固定化介质、方案、使用催化剂的实验条件和底物。在另一个例子中，通过轻度共价附着固定在氰基溴化物琼脂糖珠上，并通过界面激活对辛基琼脂糖的珠子进行不同的单一或级联化学修饰（胺化，戊基，五氢化剂，在大多数情况下的效率下，均具有阳性效率）。 。

通过共价或物理吸附在阴离子树脂上固定在阴离子树脂上。

研究人员使用了一种非常温和的方法，将遗传学修饰（在蛋白质的所需位置引入Cys，并使用它选择性地固定聚合物），并使用该技术对laTus 2进行了酶的酶，并使用该技术进行了酶，该酶是对单个杂种的pe iiol a imiol a pe a igry a a pe a a imiol a a imiol a a imiol a a pe a imiol。将脂肪酶固定在CNBR琼脂糖或乙醇琼脂糖上时，脂肪酶表现出开放式和活跃的形式，将其固定在盖子上的最终效果附近。一个更困难的目标是：在没有外部物质（例如-100）的情况下，实现脂肪酶的界面激活。为了实现这一目标，我们将各种烷烃连接在酶表面上的三个不同位置，以生成脂肪酶的界面激活，并将定向的位置诱变添加到协议中，以消除天然CYS残基，并在所有位置上均可在UMM中引入较高的位置。野生型生物催化剂的选择性合成于丁烷氧化丁烷的选择性合成。脂肪酶封盖位点上的不同定制肽。这些方法改善了不同生物转化过程中酶的特异性和对映体的选择性。

有时，酶的修饰是最终生物催化剂的物理形成的关键，在有趣的论文中，作者证明了使用聚合物的蛋白质固定在分层的钛合金中的蛋白质是不同的。

在最近的论文中，使用固定的酶封装了支撑并恢复固定脂肪酶的活性。与裸露的载体相比。

本节中要介绍的最后一篇文章是化学知识的一个巨大潜力，它是基于酶的化合物。 UE 295使脂肪酶更喜欢S型脂肪酶，使脂肪酶更喜欢使用光的可能性。

3.修饰蛋白质以改善酶固定化

在本节中，我们讨论了进行化学修饰的例子，而不是改善酶的性质，而是改变酶的附着方式。

加利福尼亚大学（伯克利大学）开发了固定的酶的固定酶。不是靶蛋白。

一些旨在化学修改酶的示例使它们可以在固定的支持上进行更好的离子交换，这意味着蛋白质在我们所知中富含与离子相反的离子。

有一些新的蛋白质修饰的例子，以促进多点的共价附着。由于酶的稳定性较低，其活性的50％稳定性增加，因此在环氧官能化的硅胶和纳米 - 硅粒子（MCM-41和SBA-15）上，脂肪酶的多点固定在pH上。改善酶的稳定性和在水解鱼油过程中的选择性。 水解-5,8,11,14,17和-4,7,13,13,16 Acid的效应比19个二六六六六六六六六六六六六六分之固定在乙烯基载体上，并在280年代均在280时增加了乙烯基载体。酶的稳定性增加了45次。

最近，一些人认为，这是一种有效的工具，可以改善细菌载体的效果，以便将脂肪酶固定在开放状态。 。

在一个有趣的示例中，固定点突变用于定向固定，并且酶的化学胺可以固定在乙醛载体上并固定固定的多点CO-价格连接。

在某些情况下，作者介绍了一些蛋白质，它们无法通过这种机制来固定它们。原始活性与原发性酶相比，碱性溶液的活性也有所改善，在重复使用后，原始活性的75％是通过群体和二氧化钛之间的螯合反应。

但是，在一个例子中，研究人员试图降低相互作用的强度。

最后一个例子表明，在氨基载体上使用养生的化学方法来固定基于PEG的L-硫酸盐酶和谷氨酸脱氢酶。

4.修改蛋白质以获得获得固定酶生物催化剂的理想策略

在这里，我们显示了固定生物催化剂的化学修改趋势和主要实例（图12）。

图12.由特定制剂引导的化学修饰。

酶的全球修改已经发布了一种非常好的方法，可以通过双功能试剂进行修改。试剂控制酶表面可以在蛋白质上进行，并将大多数蛋白质表面组的平均反应推向任何其他蛋白质。根据这些键可能会破坏氨基的试剂。但是，它们只能在轻度条件下与苯胺反应，如果我们想进一步在酶的表面引入其他化合物，则必须在酶和化合物中有群。

图13.控制并连续修改固定酶的表面。

图14.固定基于醛的化学修饰。

或可能是一种更合适的技术：这两组可以与多种蛋白质（磺胺醇，， oon ty ty ty ty the苯酚组）反应，甚至与多种化合物（例如key of of of of ）。

图15.使用第二个环氧化物或乙烯基碱基组化学修饰固定酶。

进一步探索的另一种可能性是使用诱导的紫外线辐射，以改变其特征。

图16.酶具有光变性化合物对酶和紫外线辐照的影响。

因此，近年来，已经开发了新的思想和解决方案，以结合酶的化学修饰和固定化。

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