镍亲和层析介质寿命检测方法的分析研究与结论

镍亲和层析介质寿命检测方法的分析研究与结论

目的：研究并分析镍亲和层析介质寿命的检测方法。

方法：维护清洗后的色谱柱清洗效果需检测pH、电导率、UV，实验前测柱效，如结果异常则复检柱效，TOC、电导率为主检测指标，毒素为辅助检测项目，循环100次。

结果：TOC检测值范围为22.700～262.0，RSD为77.027%；pH检测值范围为5.400～6.900，RSD为7.103%；内毒素检测值范围为0.600～1.100 EU/mL，RSD为9.443%；未检测到洗脱蛋白，电导率<0.25μs/cm；TOC洗脱峰波动较大，pH洗脱峰波动较小，电导率洗脱峰比较稳定。

结论：按比例缩小实验规模至商业生产的1/1000（规模没有固定的标准，结合实际情况），保持生产线的线性流速，以产品SOP为参考，结合产品收率、纯度、装填量、柱压，对每次循环后的结果进行评估，对结果进行统计分析，根据各指标的稳定性综合判断介质的使用寿命。

在我国生物技术水平不断提高的社会背景下，生物制药技术发展迅速，对生物制品的质量要求也逐步提高。生物制品从研究到上市，需要经过药理毒理研究、药学研究、临床试验等一系列过程，以确保生物制品的有效性、安全性和质量可控性。但有关部门已明确指出，生物制药不仅要保证生物制品的有效性，还不能影响其生产工艺的稳定性。作为生物制药工艺中的关键步骤，层析技术可以利用层析介质对培养采集的生物制品进行纯化，得到符合生产标准的生物制品。但在纯化过程中，宿主的蛋白、核酸、脂质以及内源性毒素和杂质等会残留在层析介质中，造成污染，进而在接下来的纯化过程中污染目标产品。因此明确层析介质的寿命并及时更换对提高生物制品质量具有重要意义。本研究对亲和层析介质的寿命检测进行了探讨，现报道如下。

1.材料和方法

（一）试剂。试剂包括重组蛋白（治疗性生物制品）原液、磷酸二氢钠二水合物（·2H2O）、磷酸氢二钠十二水合物（·12H2O）、氯化钠（NaCl）、咪唑（ ）、硫酸镍六水合物（NiSO4·6H2O）、鲎试剂、注射用水。

（二）设备与仪器。仪器包括：B-T100型TOC检测仪（自制）、CD-TDS电导率检测仪（自制）、PHB-1型pH手持式酸度计（自制）、电子分析天平（自制）、SW-CJ-2FB洁净工作台（自制）。

（三）平衡溶液的制备。用分析天平分别称取0.06g、0.7g、0.2g、1.36g·2H2O，加水溶解并定容至1L。置于1L容量瓶中，注入适量注射用水，轻轻振摇使完全溶解，加注射用水定容至刻度。

（四）洗脱液的制备。用分析天平称取2.2H2O、0.12H2O、29、13于1L容量瓶中，加入适量注射用水，轻轻振摇使充分溶解，再加无菌注射用水定容。用分析天平称取26.6H2O于1L容量瓶中，加入适量注射用水，轻轻振摇使充分溶解，再加注射用水定容。

（五）检测方法。各工艺参数的设定、流速、样品洗脱方法、层析柱再生等均按产品工艺相关规定执行，缓冲液、试剂均经检测合格，与生产一致，价格昂贵。本研究验证上样量仅为生产规模层析柱体积与生产上样量之比的1/1000。柱床高度要求与生产规模一致。纯化所用液体与生产一致，配液后经0.45μm膜过滤，去除颗粒。生产时需测pH、电导率、UV，产品接触时间与生产规模一致。实验前测柱效（HETP，理论塔板数），确保与生产规模一致。若产品结果异常，重新进行柱效测试。按各纯化步骤100个循环配制上样。调pH为8.0，线性流速70-75cm/h，上样，监测OD280，收集洗脱峰，测蛋白浓度。

（六）采样量。内毒素/采样瓶须干烧备用。总有机碳（TOC）采样直接采用TOC专用采样瓶，杜绝采样瓶对样品的污染，避免对本次验证造成干扰。研究中各测试项目的采样值为TOC（冲洗水）40mL、蛋白质（冲洗水）10mL、pH（冲洗水）15mL、电导率（冲洗水）10mL、内毒素（DEAE/冲洗水）2mL。

（七）测试值标准范围。TOC：测试值<500.；蛋白质：测试值0mg/mL；pH值：测试值<8.000；电导率：测试值<0.250μs/cm；内毒素：测试值<1.000EU/mL。

（八）统计学方法：采用.0软件处理数据，计算数据的RSD值，并根据数据制作折线图。

2. 结果

（一）漂洗水各项目检测结果。经100次循环检测，TOC测试值范围为22.700～262.0，RSD为77.027%；蛋白质含量为0；pH值测试值范围为5.400～6.900，RSD为7.103%；电导率检测值均<0.25μs/cm；内毒素检测值范围为0.600～1.100EU/mL，RSD为9.443%。详见表1。

（二）各项目洗脱峰结果。TOC洗脱峰波动较大，pH洗脱峰波动较小，电导率洗脱峰相对稳定，如图1所示。

讨论

在生物制药领域，层析纯化是关键步骤，层析介质循环使用次数直接影响分离纯化效果，介质寿命根据不同的产品特性和材料性质而不同。本文以金属螯合镍亲和介质为例，通过金属螯合亲和介质的原理和使用方法对介质的寿命进行测试。金属螯合亲和介质捕获蛋白质表面的氨基酸，分离对金属离子有吸附作用的多肽、蛋白质和核苷酸。研究介质寿命验证和清洗检测的原理，为不同用途的层析介质寿命研究提供思路和数据支持。介质寿命验证是药物研发的重点，尤其是生物制品。企业在进行介质寿命验证时，建议按比例缩小纯化规模，确定每一步纯化介质的使用次数，确保层析介质在使用寿命内使用，介质满足生产要求，防止交叉污染，保证产品质量。在使用过程中，未被洗脱和流过的物质或杂质会吸附在填料上。需要特定的清洗和再生程序来清洗、再生和保存层析介质，以使介质恢复到原始状态。长时间使用的介质会逐渐失去效力，如果清洗后残留的污染物量、介质使用参数的变化、产品的重要指标（纯度）和收率都失控，就意味着介质的寿命已经到期。层析是一种吸附层析，其中抗原（或抗体）与相应的抗体（或抗原）特异性结合，并且这种结合在一定条件下是可逆的。反应后，液相中相应的抗体（或抗原）可以选择性地结合到固相载体上，从而将其与液相中的其他蛋白质分离，达到分离纯化的目的。相反，如果不在SOP的控制范围内，则意味着应该更换介质。只有及时更换层析介质，才能保证生物制品的质量。本研究结果显示，TOC检测值范围在22.700～262.0之间，RSD为77.027%；pH检测值范围在5.400～6.900之间，RSD为7.103%；内毒素检测值范围在0.600～1.100 EU/mL之间，RSD为9.443%；蛋白质未检出，电导率<0.25μs/cm；TOC洗脱峰波动较大，pH洗脱峰波动较小，但电导率洗脱峰比较稳定。说明虽然TOC和pH峰图存在一定的波动，但它们的检测值均在正常标准范围内。另外，作为辅助参考指标的内毒素，最大值为1.100EU/mL，已经超出标准范围，但检测难免会有误差，计算出的平均内毒素值仅为0.967EU/mL，在标准范围内。