2023 年 12 月发表在 ACS Catalysis 上的有机硅烷功能化生物催化研究

2023 年 12 月发表在 ACS Catalysis 上的有机硅烷功能化生物催化研究

今天推送的文章是2023年12月发表在ACS上的文章《for: to Si–C–H Bonds》，通讯作者是加州理工学院的H.教授。

定向进化有可能通过改造天然酶使其在非天然底物上发挥作用来实现非生物化学。功能化有机硅化合物是有价值的化学试剂和中间体，在材料科学、药物化学和有机合成中具有广泛的应用。其中，手性α-氨基硅烷可以作为氨基酸和肽异构体以及蛋白酶抑制剂中的结构基序。通过化学方法合成α-氨基硅烷已经取得了重大进展，然而，由于使用空气敏感试剂、贵金属催化剂或需要预功能化的底物，这些方法的应用范围有限。这些限制可以通过Si-CH键活化来克服。作用于含硅分子的酶促转化相对较少。通过改造能够激活Si-H键的天然血红素蛋白，该团队的前期研究已经证明酶促转化可以生成新的Si-O和Si-C功能化的有机硅化合物（图1（a））。 为了进一步扩大酶催化在有机硅化学中的应用范围，本研究重点研究了通过生物催化亚硝基转移到 α-Si-CH 键来构建胺基功能化的有机硅化合物（图 1（b））。

首先，作者使用苄基三甲基硅烷 (1a) 和 N-乙酰基-O-戊酰羟胺 (2a) 作为亚硝基前体，并测试了大约 500 种不同的酰胺化活性变体；通过液相色谱-质谱法，在 uAmD5-5117 中观察到 Si-CH 酰胺化活性，uAmD5-5117 是一种先前为甲基环己烷的 CH 酰胺化而进化的细胞色素 P450。因此，uAmD5-5117 被用作直接酰胺化有机硅烷催化剂的定向进化的起点。

定向进化技术是利用易错PCR结合StEP重组或位点饱和诱变（SSM）对活性位点内的氨基酸残基进行随机诱变，然后利用反相液相色谱-质谱（LC-MS）和气相色谱-火焰离子化检测（GC-FID）在全细胞反应中筛选显性突变体，再利用手性超临界流体色谱（SFC）对对映体显性突变进行更深入的表征。

以uAmD5-5117为起始模板，经过4轮随机诱变和StEP重组，得到P411-SIA-528（T328A、N573D、E839G、R47H、E143K、F77S、F662C和K670I），P411-SIA-5288的活性比uAmD5-5117高34倍（TTN=68），经过第一轮epPCR（突变T327P）和FAD结构域的截短突变体，得到P411-SIA-5289，其活性比uAmD5-5117高1.6倍（TTN=111），ee值为99%。 活性位点的两轮SSM产生了最终变体P411-SIA-5291，其突变为S70M、V263L和T436A。与初始变体相比，P411-SIA-5291的总周转数增加了430倍，转化率为34%，生成了（3a），TTN为250，ee对映选择性为99%（图2a）。

接下来，使用显性突变酶研究了底物适用性。为了测试不同功能团的电子效应，作者合成了对氟（1b）、对甲氧基（1c）和对甲基苄基三甲基硅烷（1d），并评估了酶 P411-SIA-5291 对这些底物的活性（图 3a）。虽然 1a 和 1b 的大小相似，但吸电子的对氟化合物比模型底物具有更高的活性。在 1c 或 1d 中引入给电子但体积大的取代基会降低活性。

为了进一步测试不同位置甲基取代基的立体效应，作者合成了间甲基（1e）和邻甲基苄基三甲基硅烷（1h）。发现酶对 1e 的活性较低，而 1h 仅略微转化为 3h（图 3a）。将甲基从对位移至间位，最后移至邻位，增加了 Si-CH 键周围的立体体积，从而降低了生物催化剂的活性。

此外，作者合成了化合物1f和1g，考察取代对硅中心的影响，得到产物分别为3f和3g（图3a）。1f含有端烯烃基团，而1g同时含有α-Si-CH和β-Si-CH键。烯烃的叠氮化一般比碳氢键的活化容易，但酶更喜欢对α-Si-CH进行苯基官能化，生成3f。

进一步优化反应，实现产物的规模制备，从1 mmol规模反应中分离出3a，产率为52%，ee值为99%（图3b）。通过单晶X射线晶体学确定制备规模反应所得产物的绝对构型为（R）。同样，从0.1 mmol规模反应中分离出3f和3g，产率分别为32%和25%。最后，P411-SIA-5291可以使用三种相关的亚硝基前体合成3a（图3c）。

综上所述，作者开发了一种生物催化策略，通过用酰基亚硝基中间体激活 α-Si-CH 键来构建手性 α-氨基硅烷。进化的酶可以在氧气存在下发挥作用，并且可以在非天然有机硅底物上起作用。这种新的生物催化平台扩展了酶的非天然化学空间，为未来具有挑战性的 Si-CH 插入反应和 CH 键的研究奠定了基础。