澳大利亚的C..摘要与受盐影响的酶相比，分子动力学计算揭示了钠离子在增加耐盐性酶的

澳大利亚的C..摘要与受盐影响的酶相比，分子动力学计算揭示了钠离子在增加耐盐性酶的

今天的文章发表在2023年7月的《of a to an》上，通讯作者是C. 。

概括

与受盐影响的酶相比，从耐盐性强的生物体中表达的酶表现出许多变化，包括氨基酸偏向性和较低的 α 螺旋含量、较低的溶剂可及性和负表面电荷。在此，作者证明，只需修改表面残基，就可以使酶具有耐盐性。碳酸酐酶 II 的合理设计分三个阶段进行，总共替换了 18 个残基，晶体结构证实变化仅限于表面残基。设计的酶的催化活性和热展开温度在高盐浓度下增加，表明它们向耐盐性转变，而野生型酶则发现相反的反应。分子动力学计算揭示了钠离子在提高耐盐酶稳定性方面发挥的关键作用，主要是通过与高度有序的第一个 Na 离子水合壳相互作用。首次展示了一种在野生型酶中产生极端耐盐性的方法，这是一种在工业生物催化中具有广泛应用的特性。

对于许多酶来说，最佳操作环境的特点是温度、pH 和盐度处于中等范围，偏离这些条件会导致蛋白质快速变性。具体而言，高盐条件会导致中度嗜盐酶聚集，即盐敏感性，这是因为高浓度离子会干扰氨基酸残基之间的静电相互作用，导致疏水效应增加和结构崩溃。然而，从生活在高盐环境（如死海）中的生物体中分离出的嗜盐酶在这些条件下是稳定的并且表现最佳。

与非嗜盐酶相比，嗜盐酶表面的负电荷密度通常明显较高，赖氨酸和半胱氨酸残基的含量降低，但无规卷曲结构的数量较多，而α螺旋较少，天冬氨酸和疏水残基的含量较高。嗜盐蛋白中疏水残基大小的总体减小被认为是为了补偿高盐浓度下介电性能增加所带来的疏水效应的增加。相反，嗜盐生物中表现出对高盐条件适应性的酶在典型的重组系统中不易表达和折叠，在低盐条件下非常不稳定。

突变体1-4（M1-M4）的晶体结构

野生型 (WT) 和设计的 M1-M4 碳酸酐酶在大肠杆菌中有效表达，并使用标准程序纯化为折叠和功能性酶。除 N62D 外，本研究中的所有其他替换均未在碳酸酐酶 II 中研究过。替换最多的酶 M4 具有 10 个额外的 Asp 和 8 个额外的 Glu 残基，但与 WT 相比，有 5 个 Asn、4 个 Gln、3 个 Lys、2 个 Val 和 1 个 Gly、Leu、Arg 和 Thr 残基较少。获得了 WT 和工程酶的晶体结构以确认改变的残基的存在，活性位点残基的定位不受影响，并且还比较了设计蛋白质与 WT 的整体结构相似性。天然存在的嗜盐酶在蛋白质数据库中代表性不足，因为这些酶通常高度溶于用于产生中度嗜盐酶晶体的“盐析”盐中。

表 1 显示了 WT 和设计酶的晶体统计数据。四种工程酶的结构与野生型酶几乎完全重叠（M4 的最大均方根偏差 (RMSD) = 0.42 Å），它们的二级结构没有明显差异。四种变体中的三种（M1、M3 和 M4）包含突变 N62D，该突变之前曾被报道过并被证明会降低人 CAII 的活性，这是由于将具有催化重要性的 His64 的侧链保持在“向外”位置，而该残基的侧链则处于“向内”构象。三种含有 N62D 的酶（M1、M3 和 M4）的晶体结构也显示 His64 为外旋转异构体，而 M2 显示其为内旋转异构体和外旋转异构体的比例大致相等。 与野生型相比，M1-M4 中其他表面残基的一些方向也发生了变化，尽管除了 N62D 之外，没有一个残基靠近活性位点。尽管突变体之间的水网络存在差异，但由于数据集之间的分辨率差异，很难进行有意义的直接比较。M4 的结构中存在额外的电子密度，这似乎与 D130E 替换一致，但这不包含在任何突变体中。基因和蛋白质分析不支持在此位置进行任何替换，并且额外的电子密度仍未建模。

热膨胀导致 M4 含盐量极高

使用差示扫描荧光法 (DSF) 评估了 pH 范围 7-11 中添加的盐、离子液体以及变性剂 GuHCl 和尿素对 WT 和 M1-M4 酶的热展开值的影响。在所用的缓冲液中，pH 范围 8-9 的 Tris-HCl 提供了最高的热展开值 (Th)，本节中呈现的结果是指在 50 mM Tris-HCl pH 8.5 中进行的实验。在这些 Th 缓冲条件下的酶值为 WT 67.5、M1 66.5°C、M2 50.0°C、M3 50.0°C 和 M4 42.5°C。

添加所有浓度的硫酸钠都会增加 M2-M4 的热解折叠温度，其中 M4 受到的影响最大。M4 的解折叠温度在 4 °C 时增加了 22.5 °C，使其解折叠温度达到 WT 的最高 Th。相反，在硫酸钠存在下，WT 的解折叠温度降低了 2 °C，M1 表现出中间响应。在高盐度条件下研究了 NaCl 对解折叠温度的影响，即正常海水具有非常高的解折叠温度，约为 600 mM NaCl，这是此处测试的最低浓度。同样，在热解折叠测定中添加氯化钠对 WT 和 M4 产生了对比效果；WT 的 Th 随着氯化钠浓度的增加而降低，而 M4 随着氯化钠浓度的增加而变得越来越稳定。 中间酶（M1-M3）的去折叠温度呈现过渡关系，M3不受氯化钠添加的影响，而对M1和M2的影响介于WT和M3之间。在测试的钠盐中，对去折叠温度负面影响最大的是硝酸钠，它显著降低了所有碳酸酐酶的Th，除了M4，2 M几乎不对其产生影响。

在 DSF 分析中，向酶中添加变性剂尿素和盐酸胍同样影响了 WT 和 M1-M3 酶的热解折叠温度，即添加变性剂 Th。然而，由于 M4 受盐酸胍的影响小于其他酶，尽管尿素的影响相似。虽然在碱性缓冲条件下添加盐可以提高 M4 的热稳定性，但任何碳酸酐酶的解折叠温度均不超过缓冲液中天然 bCAII 的解折叠温度。

图 1 WT 和 M1-M4 碳酸酐酶的热展开分析。实验是在浓度不断增加的 (a) 硫酸钠、(b) 氯化钠、(c) 硝酸钠和 (d) 离子液体 EtOH-AF 下进行的。对于每种酶，热稳定性由盐和 50 mM Tris-HCl 缓冲液 pH 8.5 中的 DSF 与单独缓冲液之间获得的热展开值 (Th) 差异表示。

在SDS中，M4的二级结构更稳定

WT 比 M4 更容易受到 SDS 二级结构破坏的影响，这通过圆二色性 (CD) 观察到。在 0.0375% w/v SDS 下，大多数 β 片层结构缺失，并形成了额外的 α 螺旋，而在相同浓度的 M4 下，二级结构破坏相对较小。在进行 CD 分析之前将酶预孵育 60 分钟，得到的光谱与 SDS 暴露后立即读取的光谱非常相似。相反，在 250- 之间的每个测试浓度下，WT、M3 和 M4 在添加 GuHCl 后二级结构的损失相似。

图2 WT和M4在SDS中的圆二色谱分析

高盐条件下M4的催化活性增加

通过在存在和不存在一系列盐和变性剂的情况下用标准测定法测量活性来评估 WT 和工程酶 M1-M4 的催化活性。在标准分析条件和低离子强度 (I = 0.2 M) 下测量的 M1-M4 的 4-NPA 酯酶催化速率与 WT 相比降低，如表 2 所示。M1 和 M2 都含有六个替换，每个替换对应一个变体，但酶在低离子强度条件下表现出相似的催化活性。然而，只有 M1 携带 N62D 替换，其对 CO2 水合和酯酶的催化活性分别为 WT 活性的 86% 和 61%（表 2）。氨基酸变化最多的 M3 和 M4 在这些条件下表现出最低的酯酶活性，其中 M4 显示出约 66% 的降低。 在pH值6.8-8范围内测量的酯酶活性表明，所有酶在pH值8时活性最强，这表明活性亲核试剂和相邻残基的性质没有改变。

4-NPA缓冲液中添加硫酸、氯化钠和硝酸钠对表观活性有很大影响。添加250-1,500 mM浓度范围内的硫酸钠对M3和M4的催化活性有强烈的积极影响，这些增加明显高于WT的活性。在添加硫酸钠时，在相同条件下M4的酯酶活性最高。在测定混合物中浓度为750 mM或更低时，氯化钠对所有酶的酯酶活性抑制高达40％，其中M4受到影响最小。在及以上时，M1-M4酶的酯酶活性高于没有氯化钠的情况，而M3和M4酶的活性显著增加。然而，在碱性缓冲条件下，没有发现M1-M4活性超过WT的情况。

硝酸钠是碳酸酐酶II酶的抑制剂，因为它与碳酸盐是等电子的，并且通过添加浓度为50至100％的硝酸钠，所有酶都被抑制。然而，与对照条件相比，M3和M4在每种酶的剩余活性百分比方面对硝酸盐抑制的敏感性显着降低。也就是说，在底物浓度范围内，M3和M4观察到显着更高的浓度来抑制活性。此外，半抑制浓度值随着碳酸酐酶表面酸性残基上的取代数而增加，表明静电相互作用对硝酸盐的抑制能力有很大的影响。

图3 盐和变性剂对WT和M1-M4酯酶活性的影响

Na离子在稳定M4结构中的作用。

分子动力学模拟揭示了阳离子、阴离子和酶之间复杂的相互作用。一般来说，Na 离子与 M4 位点的相互作用比与 WT 的相互作用更大。最长的 Na 离子停留时间，即阳离子与酶直接相互作用的时间，发生在螯合环境中存在三个或更多配位氧原子的情况下，这些氧原子通常来自 Glu 和 Asp 侧链以及主链羰基氧原子。使用 NaCl、NaNO3 和 模拟计算了 Na 离子与酶表面相互作用的径向分布函数 (RDF)。在三种盐模拟中，在 2.2、2.7、3.5 和 B4.4-5.1Å 处有四个不同的关联距离，其中第一个和最后一个分别是直接配位的 Na 离子和具有氢键的完全水合的 Na 离子的主要峰。对整个酶的比较表明，在所有盐条件下，Na 离子与 M4 的结合明显高于 WT。

阴离子和蛋白质的 RDF 分析表明，与 M4 结合的硝酸盐和硫酸氢盐的数量明显低于与 WT 结合的数量；然而，对于 Cl 离子没有观察到这种差异，这表明两种酶之间几乎没有差异。硝酸盐和硫酸氢盐的最短结合峰出现在 ~1.9 Å，而 Cl 离子的结合峰位于 2.3 Å。硝酸盐和硫酸氢盐有四个结合峰，表明存在水介导的相互作用；然而，硫酸氢盐的定义略有不同。Cl 离子显示出两个不同的峰，但与各自系统中的多氧阴离子相比，结合水平要低得多。

图 4. 整个酶中阳离子和阴离子的径向分布函数 (g(r))。WT 和 M4 的 Na 离子 (a) 和阴离子 (b) 的 MD 模拟显示了超过 50,000 帧的产生轨迹。

综上所述

为了更好地了解控制酶嗜盐性的关键因素并开发用于高盐条件的耐盐生物催化剂，作者通过选择嗜盐酶中存在的几种机制之一进行了合理的酶设计：增加酶表面酸性残基的发生率。选择研究充分的碳酸酐酶 II 进行合理设计，因为它具有有效的 CO2 水合活性，并且可以在大肠杆菌中进行异源表达。在这里，作者首次描述了通过改变 18 个表面残基成功地将中度嗜盐酶重新设计为极度耐盐直系同源物，即在 3 M NaCl 及以上条件下有活性的酶。从中度嗜盐酶到极度耐盐酶的转化是分阶段进行的，以评估替换对整体蛋白质稳定性和耐盐程度的影响。 此外，分子动力学计算表明，酸性残基与互补螯合物阳离子的扩展结合以及通过阳离子高度有序的水化壳的相互作用是耐盐性的主要机制。

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