高耐盐酶的理性设计与高度有序的第一钠离子水化壳相互作用
2024-05-27 07:03:34发布 浏览182次 信息编号:73091
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高耐盐酶的理性设计与高度有序的第一钠离子水化壳相互作用
【研究简介】
高度耐盐的酶往往表现出多种特征,包括氨基酸偏向性、低α螺旋含量、溶剂可及性和表面负电荷。本研究表明,只需修改表面氨基酸残基即可产生耐盐酶。碳酸酐酶II的合理设计分三个阶段进行,共替换18个残基。晶体结构证实这些氨基酸改变仅限于表面残基。设计的酶在高盐浓度下表现出催化活性和热去折叠温度的提高,表明突变酶向耐盐方向转变。通过分子动力学计算,该研究揭示了Na+与高度有序的第一个钠离子水合壳相互作用,对提高耐盐酶的稳定性起关键作用。
【引用】
对于大多数酶来说,最佳工作环境通常在温度、pH和盐度的适中范围内,偏离这些条件可能导致蛋白质快速变性。具体而言,高盐条件可能导致中度嗜盐酶(盐敏感酶)聚集,因为高浓度离子会干扰氨基酸残基之间的静电相互作用,导致疏水效应增强,随后结构崩溃。然而,从生活在高盐环境(如死海)的生物中分离出嗜盐酶,这些酶在高盐条件下稳定且发挥最佳功能。与非嗜盐酶相比,嗜盐酶通常表面负电荷密度明显较高,赖氨酸和半胱氨酸残基含量较低,无规卷曲结构含量较高,α-螺旋含量较低,天冬氨酸和小疏水残基含量较高。 嗜盐蛋白中疏水残基体积的整体减少被认为是对高盐浓度带来的疏水效应增强的一种补偿。
目前,嗜盐酶作为盐水、离子液体 (IL) 和离子洗涤剂等高盐环境中的生物催化剂,受到越来越多的关注。传统上,嗜盐酶是从天然来源中发现的,但这种方法在实现重组蛋白表达、折叠和稳定性,甚至所需的催化活性方面会遇到重大障碍。另一种生物发现方法是将耐盐性有目的地引入现有的生物催化剂中,这些生物催化剂已经具有所需的催化活性、易于异源表达或具有其他关键特性。 为了更好地了解影响酶耐盐性的关键因素,开发适用于高盐条件的耐盐生物催化剂,本研究通过选择嗜盐酶中存在的耐盐机制之一(增加酶表面酸性残基)对酶进行合理设计,成功地将中度嗜盐酶重新设计为极度耐盐酶,使其在3 M NaCl及以上条件下仍有活性,并通过分子动力学揭示其耐盐的主要机制。
【介绍】
1. 突变体1-4(M1-M4)的合理设计和晶体结构
对牛碳酸酐酶 II (bCAII; .1) 的氨基酸序列进行分析和比对,选择变化最大的残基作为突变的候选残基。突变的残基还必须是晶体结构中蛋白质表面的残基,并且不参与重要的相互作用。共选择了 18 个残基进行阶段性突变。设计的酶中的残基变化总结在序列比对图 (图 1) 中,与野生型 (WT) 相比,M4 酶的表面电荷变化如图 2 所示。WT 和设计的 M1-M4 碳酸酐酶在大肠杆菌中表达,并通过标准程序纯化为折叠和功能性酶。除了 N62D 之外,本研究中的其他氨基酸取代在碳酸酐酶 II 中尚未报道过。 氨基酸替换最多的M4与WT相比,多出了10个Asp和8个Glu残基,少了5个Asn、4个Gln、3个Lys、2个Val、1个Gly、Leu、Arg和Thr残基。对WT和设计酶的晶体结构进行了验证,证实了残基的变化和活性位点残基不受影响。WT和设计酶的晶体数据如表1所示。4个设计酶的结构与WT酶几乎完全重合(最大均方根偏差(RMSD)为0.42 Å,M4),二级结构无明显差异。
图1. WT与合理设计的耐盐酶(M)的氨基酸序列比对。阴影部分残基为突变残基,各突变体中的特征性突变残基以加粗数字标注,即该突变为M1、M2或M4所特有。
图 2. WT 和 M4 的表面电荷分布。正电荷(蓝色)和负电荷(红色)投射到 WT(a、c)和设计的 M4(b、d)碳酸酐酶 II 的溶剂可及表面(1.4 Å 探针半径)上。
表 1. WT 和设计酶(M1-M4)的蛋白质结晶数据。
2. M4 在热展开过程中的极端耐盐性
采用差示扫描荧光法(DSF)在pH值7-11范围内评估了盐、离子液体(ILs)和变性剂(GuHCl和尿素)的添加对WT和M1-M4酶热展开值(Th)的影响。在缓冲液中,WT酶的Th值为67.5℃,M1为66.5℃,M2为50.0℃,M3为50.0℃,M4为42.5℃。在所有浓度下,添加都会增加M2-M4的Th值,其中M4受到的影响最为显著(图3a)。在1800 mM浓度下,M4的Th值增加了22.5℃,达到WT的最高值。相反,的存在使WT的Th值降低了2℃,而M1表现出中等程度的影响。 高盐条件下,考察了NaCl对Th值的影响,同样,WT和M4表现出了明显的效果:WT的Th随着NaCl浓度的增加而降低,而M4则愈发稳定(图3b)。中间酶(M1-M3)的Th值呈现过渡关系,M3不受NaCl添加的影响,而M1和M2的影响则介于WT和M3之间。在所测试的钠盐中,NaNO3对Th值的负面作用最大,它以浓度依赖性的方式显著降低所有碳酸酐酶的Th值,但M4除外,即使在高达2 M的盐条件下,其Th值也几乎不受影响(图3c)。
图 3. WT 和 M1-M4 碳酸酐酶的热展开分析。实验在浓度不断增加的 (a)、(b) NaCl、(c) NaNO3 和 (d) 离子液体 EtOH-AF 中进行。对于每种酶,热稳定性表示为在单独的盐和缓冲液 (50 mM Tris-HCl,pH 8.5) 中通过 DSF 测量的热展开值 (Th) 的差异。
在50 mM Tris-HCl pH 8.5中对WT和M1-M4酶进行了四种离子液体(IL)的测试。EtOH-AF的添加对酶的影响有明显的差异:WT和M1的Th值随着IL浓度的增加而降低,而对于M2-M4,对Th值的正向影响逐渐增加(图3d)。乙基-AF,乙基-NO3和DMI-DMP的添加对WT和设计的酶具有相似的效果,所有IL均降低了WT和M1-M3的Th值,并且随着浓度的增加,影响变得越来越显著。然而,与其他酶相比,M4的Th受IL的影响要小得多,当添加乙基-AF时甚至还有正向影响。 在DSF分析中,向酶中添加变性剂(尿素和GuHCl)对WT和M1-M3酶的Th值的影响相似,即加入变性剂后所有酶的Th值变化均为负值(图4a,b)。但M4的Th受GuHCl的影响小于其他酶,但受尿素的影响也相似。上述结果表明,虽然在缓冲溶液中添加盐可以增加M4的热稳定性,但它们均未超过缓冲溶液中天然bCAII的Th值。
图4. WT和M1-M4碳酸酐酶在(a)尿素和(b)盐酸胍中的热展开分析。
3. M4在SDS中的二级结构更稳定
通过圆二色性 (CD) 光谱法观察到,WT 比 M4 更容易受到 SDS 二级结构破坏的影响(图 5)。暴露于 0.0375% (w/v) SDS 后,WT 酶的大部分 β 片层结构消失,并形成了额外的 α 螺旋结构,而在相同浓度下,M4 显示出相对较少的二级结构破坏(图 5)。在 CD 分析之前将酶预孵育 60 分钟,产生的二级结构破坏模式与 SDS 暴露后立即分析的模式非常相似。
图 5. WT 和 M4 的圆二色性分析。通过圆二色性光谱法,随着 10 mM Tris-HCl(pH 8)中去垢剂 SDS(% w/v)浓度的增加,确定了 WT 和 M4 碳酸酐酶中 α-螺旋和 β-片层二级结构含量的平均百分比。
4. 高盐条件下M4催化活性增强
在存在和不存在一系列盐和变性剂的情况下,通过标准测定评估了 WT 和设计酶 M1-M4 的催化活性。如表 2 所示,在标准测定条件和低离子强度(I = 0.2 M)下,M1-M4 的 4-NPA 酯酶催化速率与 WT 相比降低。M1 和 M2 突变体都有六种氨基酸取代,但每个突变体的取代都是独一无二的,然而酶在低离子强度条件下表现出相似的催化活性。只有 M1 携带 N62D 突变,其 CO2 水合和酯酶催化活性分别为 WT 活性的 86% 和 61%(表 2)。氨基酸突变数量最多的 M3 和 M4 在这些条件下表现出最低的酯酶活性,与 WT 相比,M4 的活性降低了约 66%。
表 2. WT 和设计酶(M1-M4)的催化活性。
向 4-NPA 测定缓冲液中添加硫酸钠、氯化钠和硝酸钠对表观催化活性有很强的影响。在 250-1500 mM 浓度范围内添加对 M3 和 M4 的催化活性有很强的积极影响,并且这种增加明显高于 WT(图 6a)。在 1500 mM 时,M4 的酯酶活性最高,并恢复到与 WT 相同的初始速率。在测定混合物中添加浓度为 750 mM 及以下的 NaCl 可抑制所有酶的酯酶活性高达 40%,其中 M4 受影响最小(图 6b)。在浓度为 2500 mM 及以上时,M1-M4 酶的酯酶活性超过了没有 NaCl 时的活性,其中 M3 和 M4 的活性显著增加(图 6b),而在基础缓冲液条件下,M1-M4 的活性不超过 WT。
图 6. 盐和变性剂对 WT 和 M1-M4 酯酶活性的影响。(a)、(b) NaCl、(c) NaNO3 和 (d) SDS 中的酶活性占对照活性的百分比。盐浓度以毫摩尔表示,SDS 浓度以 % w/v 表示。对照活性是未添加盐的酶活性。
NaNO3是碳酸酐酶II的抑制剂,在50-3000 mM浓度下加入NaNO3后,所有酶均受到抑制。然而,M3和M4对硝酸盐的抑制不太敏感,以每种酶与对照条件相比的剩余活性百分比来衡量(图6c),即M3和M4的50%活性被抑制的浓度(IC50)明显更高。此外,随着碳酸酐酶表面酸性残基的取代次数增加,IC50值也随之增加,这表明静电相互作用对硝酸盐抑制的效力有很大影响。蛋白质变性离子洗涤剂SDS的加入对所有酶的活性都有负面影响;然而,M4的酯酶活性受影响最小,在0.2% w/v SDS存在下,其活性明显高于其他碳酸酐酶(图6d)。
5. Na+在稳定M4结构中的作用
分子动力学模拟揭示了阳离子、阴离子和酶之间复杂多样的相互作用。总体而言,Na+阳离子与M4相互作用的位点比WT多。最长寿命的Na+停留时间,即阳离子直接与酶结合的时间,发生在螯合环境中,例如三个或更多配位氧原子,通常由Glu和Asp侧链和主链羰基氧原子提供。计算了NaCl、NaNO3和模拟中Na+与酶表面的径向分布函数(RDF)。在三种盐的模拟中出现了四个不同的结合距离,分别为2.2、2.7、3.5和4.4-5.1 Å,第一个和最后一个峰分别对应于直接配位的Na+和通过氢键完全水合的Na+(图7)。WT和设计的酶的比较表明,在所有盐条件下,Na+与M4的相互作用明显高于与WT的相互作用。
阴离子和蛋白质的 RDF 分析表明,NO3- 和 HSO4- 与 M4 的相互作用明显小于与 WT 的相互作用;然而,对于 Cl-,酶之间几乎没有显著差异(图 7)。NO3- 和 HSO4- 的最短结合峰出现在约 1.9 Å,而 Cl- 的结合峰出现在 2.3 Å。NO3- 和 HSO4- 还有四个额外的结合峰,表明存在水介导的相互作用。Cl- 显示出两个不同的峰,但与相应系统中的多氧阴离子相比,结合程度较低。
图 7. 阳离子和阴离子相对于酶的径向分布函数 (g(r))。在三种盐条件下,WT 和 M4 的 MD 模拟显示了 (a) Na + 和 (b) 阴离子的 RDF。
【概括】
许多典型的嗜盐酶的生物物理和组成特征可以从比较基因组学、蛋白质组学和晶体结构分析中推导出来。但本研究发现,仅仅增加表面酸性残基的数量和分布就足以产生具有极高耐盐性的酶,在高盐浓度下催化活性和热展开温度都有所提高。这里展示的设计原则可以很容易地应用于其他中度嗜盐酶。此外,本研究发现,增加阳离子与耐盐酶表面酸性残基的结合频率和结合时间,不仅可以稳定表面结构,还可以增加阴离子的排斥力,对耐盐酶的稳定性起着关键作用。
【原文出处】
, AC et al. of a to an. Nat. . 6:10278 doi: 10.1038/ (2015).
原文链接:
指导老师:王占辉
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