甲醇产能过剩，开发下游产品迫在眉睫，甲基营养菌或成新方向

甲醇产能过剩，开发下游产品迫在眉睫，甲基营养菌或成新方向

甲醇是重要的有机化工基础原料。甲醇可以采用多种原料（如天然气、煤、石油、乙炔尾气等）生产。世界甲醇生产以天然气为主，我国以煤炭为主[1]。目前，煤制甲醇的合成技术已较为成熟。随着煤化工行业的快速发展，大型甲醇装置陆续投产，甲醇成本日益下降。我国甲醇产能已突破5000万吨/年，并持续增加。但国内甲醇需求不足一半，导致产能过剩[2-3]。因此，迫切需要开发甲醇下游产品[4]。

甲基营养菌是指能以甲基化合物为唯一碳源和能源生长的一类微生物，能将自然界取之不尽用之不竭的单碳化合物转化为碳源和能源（估计约83至2.73亿吨甲醇）每年向大气中释放6亿吨甲烷[6]），可以解决糖类原料在发酵过程中的限制，扩大石化原料的应用范围，因此对于甲基营养型微生物来说非常重要。代谢研究具有重要意义。甲醇利用细菌是甲基营养型细菌，比甲烷氧化型细菌更容易培养。它们可以利用甲醇获取能量，并将其转化为蛋白质和各种次级代谢产物，包括辅酶、维生素B12、吡咯喹啉醌（PQQ）、丝氨酸、聚β-羟基丁酸（poly-β-，PHB）、类胡萝卜素等。产品可用作药物、食品添加剂、生物防治剂等，具有良好的应用前景。目前比较成熟的技术是饲料用甲醇蛋白[7]。南京工业大学生化技术中心培育出产甲醇蛋白菌株并通过小室试验；达到1吨/年和5吨/年。生产规模[8]。一美集团以毕赤酵母YM-SCP02为生产菌株，甲醇蛋白（细胞干质量）最高产量为19.3 g/L[9]。以甲醇为碳源的毕赤酵母表达系统已表达数千种外源蛋白，并拥有大规模工业化高密度生产发酵工艺。表达重组蛋白时，已成功扩大至10 000 L [10]。还有一些微生物可以以甲醇为唯一碳源生长，并能分泌高附加值的生物活性物质[11]，如：吡咯喹啉醌[12-15]、氨基酸[16-18]、维生素[19] ]、多糖[20]、有机酸[21-22]等。由于甲醇具有较强的生物降解性，甲醇利用菌在含甲醇工业废水的处理中也具有一定的应用价值[23-26]。李宝庆等. [23]筛选了一株耐500 mg/L甲醇的甲醇利用菌。降解率可达97.75%。孔庆生等筛选菌株SMD11。 [24]对0.6%（V/V）甲醇的降解率为82.5%。田丹丹等筛选的甲醇利用菌株WGM16。 [25]60小时时的降解率为82.5%。 1%（V/V）甲醇的降解率为75%。

目前，国内甲醇蛋白及相关生化产品的产业化仍处于起步阶段，发酵成本降低、优质高效菌种选育、提取工艺优化等诸多关键技术有待探索并紧急研究。本研究对气化厂甲醇车间的甲醇利用菌进行分离纯化，建立相关微生物资源库，旨在为利用微生物资源开发甲醇下游生化产品提供理论依据和新的实验材料。

1 材料与方法 1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

沿河南气化厂甲醇生产线地下污水管道监测口挖取10～15 cm深的土壤样品。共获得7个土壤样品。采集的样品置于统一的样品袋中，并做好标记和编号。

1.1.2 化学试剂

甲醇、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸铵、硝酸钾（均为分析纯）：；硫酸镁、氯化钙、氯化钠（均为分析纯）：；蛋白胨（生化试剂）：； Taq聚合酶链式反应（链式PCR）混合，I核酸染色：；脱氧核糖核酸（酸、DNA）、细菌基因组DNA提取试剂盒：。

1.1.3 培养基

无机盐液体培养基：磷酸氢二钾7.5g/L、磷酸二氢钾2.0g/L、七水硫酸镁0.2g/L、无水氯化钙0.015g/L、氯化钠0.5g/L、硫酸铵2.0g/L L、加入1L蒸馏水。 121℃高压蒸汽灭菌20分钟。

无机盐固体培养基：磷酸氢二钾7.5g/L、磷酸二氢钾2.0g/L、七水硫酸镁0.2g/L、无水氯化钙0.015g/L、氯化钠0.5g/L、硫酸铵2.0g/L L、琼脂粉20 g/L，加蒸馏水1 L。 121℃高压蒸汽灭菌20分钟。

1.2 仪器设备

PHS-25B数字酸度计：； 752N紫外可见分光光度计：； HC-2064高速台式离心机：； LDZM-60KCS-II立式压力蒸汽灭菌器：；电子天平：； LRH-150生化培养箱、THZ-300台式恒温摇床：； FC多功能酶标仪：； XSP-2CA双目生物显微镜：。

1.3 方法

1.3.1 甲醇利用细菌的富集和分离

准备 500 mL 无机盐培养基。吸取 50 mL 培养基放入 8 个已灭菌的 250 mL 锥形瓶中，编号为 1 至 8。然后称取 1 至 7 号土壤样品 0.5 至 1.0 g，放入相应的编号中。在锥形瓶中，8号瓶用作无菌对照。 8份样品加入2%（V/V）甲醇作为碳源，恒温（34℃，180 r/min）富集培养48 h，下次加入2%（V/V）甲醇日，并转入。 2次（每次48小时）。

菌液富集培养完成后，从1～8号锥形瓶中取少量菌液，均匀涂于含1.5%甲醇（V/V）的无机盐固体培养基表面，倒置培养34℃培养基，每天观察菌落生长情况（8号板作为空白对照）。

1.3.2 甲醇利用菌的分离纯化

待1～7号培养基中明显观察到细菌生长后，挑出生长速度最快的细菌，转移至含1.5%（V/V）甲醇的无机盐固体培养基中。等待细菌生长良好并再次转移。抓住。在第三次转移中，从第二次转移的平板中挑取细菌细胞进行划线、分离和纯化。待生长良好后，挑取划线平板上明显的单菌落，再次划线、分离纯化。挑取平坦生长状态良好的单菌落，转移至斜面培养基上培养（每个单菌落转移至3个斜面）。斜面培养基上的细菌生长良好后，放入4℃冰箱备用。

1.3.3 菌株形态观察及生理生化鉴定

将分离的生长优势菌株划线接种到含有1%（V/V）甲醇的无机盐固体培养基中，34℃恒温培养3～5天。观察菌落形态、颜色、纹理等；选择要测试的样品。将菌苔革兰氏染色，10×100油镜观察菌体形态。细菌的生理生化鉴定主要参考《常见细菌系统鉴定手册》[27]，生理生化鉴定试剂的制备方法主要参考文献[28]。

1.3.4 菌株的分子生物学鉴定

分子生物学鉴定采用16S rDNA基因序列分析。

细菌总DNA的提取：使用细菌基因组DNA提取试剂盒进行提取。方法请参见试剂盒说明书。

16S rDNA基因序列的扩增：扩增引物（上游引物：27F：5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'，下游引物：1492R：5'-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3'）， PCR扩增条件为94℃预变性5分钟； 95℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸1分钟（30个循环）；最后72℃延伸10分钟。

16S rDNA基因序列测序与分析：对扩增后的16S rDNA基因序列进行测序。测序结果使用国家生物技术信息中心（NCBI）数据库中的基本局部工具（BLAST）程序和MEGA软件（5.1）中的邻接（NJ）进行序列比对。 ）构建微生物系统发育树的方法。

1.3.5 分析检测

(1)细菌生长的测定

从平板上挑取单菌落，接种到以1.0%（V/V）甲醇为唯一碳源的无机盐液体培养基中，在摇床上34℃、180r/min培养。细菌生长量的测定采用分光光度法测定，以波长600nm处的光密度表示，测定时以空白培养基作为参比。

(2) 甲醇降解率的测定

采用变色酸分光光度法测定样品中残留甲醇含量，参考于波等的方法。 [29-30]略有修改。

一个。标准曲线绘制

分别吸取 0.5%甲醇标准溶液 0、4 μL、8 μL、12 μL、16 μL、20 μL、24 μL、28 μL、32 μL、36 μL、40 μL 于 4 mL 离心管中，用 40 µL 蒸馏水作为空白。实验组先加入0.4 mL 25%硫酸溶液，再加入0.2 mL 1%高锰酸钾溶液，摇匀，室温放置5分钟；加入0.2mL亚硫酸钠溶液，摇匀，加入2mL浓硫酸，摇匀后，冷却至室温；加0.5%变色酸溶液0.2 mL，摇匀，沸水加热20分钟，冷却至室温并稀释至4 mL，用分光光度计在波长574 nm处测定吸光度值，绘制标准品不同甲醇的曲线。

b.培养基中甲醇残留量的测定

将菌株4311的对数生长期培养物定量接种，在以甲醇为唯一碳源的无机盐液体培养基中恒温培养。定期取样200 μL培养液，12 000 r/min离心5 min，取上清液40 μL压片。按上述方法测定，带入标准曲线回归方程计算出甲醇含量。

c.甲醇降解率的计算[31]

甲醇降解率的计算公式如下：

式中：

1.3.6 菌株生长条件和降解条件优化

以甲醇体积分数、初始pH值、NaCl质量分数、氮源和最佳氮源添加量为影响因素，分别以细菌生长量和甲醇残留量为评价指标，考察了不同条件下菌株的生长和性能。检查培养条件。甲醇的降解。

(1)甲醇体积分数的测定

将对数生长期培养物接种到甲醇体积分数为0、0.5%、1.0%、1.5%和2.0%的液体培养基中。同时，以一组未接种的培养基作为对照，在34℃下培养，并在180℃下以r/min恒温振荡培养。定期取样测定其值和甲醇含量，考察甲醇体积分数对细菌生长和甲醇降解的影响。

(2)初始pH值的测定

将对数生长期培养物接种到以1.0%（V/V）甲醇为唯一碳源的无机盐液体培养基中。初始pH值分别调整为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，34℃孵育。 ，180r/min恒温振荡培养。定期取样测定其值和甲醇含量，并考察初始pH值对细菌生长和甲醇降解的影响。

(3) NaCl质量分数的测定

将对数生长期培养物接种到以1.0%（V/V）甲醇为唯一碳源、NaCl质量浓度分别为0.05%、0.50%、1.00%、2.00%和3.00%的无机盐液体培养基中。 34°C、180 r/min 恒温振荡培养。定期取样测定其值和甲醇含量，考察NaCl质量分数对菌株生长和甲醇降解的影响。

(4)氮源的测定

将对数生长期培养物接种到以1.0%（V/V）甲醇为唯一碳源的无机盐液体培养基中。培养基的氮源为硝酸钾、硫酸铵、蛋白胨和尿素。氮源添加量浓度为2.0g/L，34℃、180r/min恒温振荡培养。定期取样测定其值和甲醇含量，并考察氮源类型对细菌生长和甲醇降解的影响。

(5)氮源添加量的确定

将对数生长期培养物接种到以1.0%（V/V）甲醇为唯一碳源的无机盐液体培养基中。培养基中蛋白胨的添加量为0.5g/L、2.0g/L、4.0g/L。 、6.0 g/L、8.0 g/L、10.0 g/L，34℃、180 r/min恒温振荡培养。定期采样测定值和甲醇含量，考察氮源添加对菌株生长和甲醇降解的影响。

1.3.6 菌株4311对不同浓度甲醇的降解率测定

在上述甲醇降解条件优化的基础上，将对数生长期培养物接种到以1.0%（V/V）和0.5%（V/V）甲醇为唯一碳源的无机盐液体培养基中。在最佳条件下接种培养，定期取样，用变色酸分光光度法测定培养基中残留甲醇的含量。同时以未接种的无机盐液体培养基作为对照，计算甲醇的生物降解率并绘制甲醇降解曲线。 ，考察菌株4311在优化条件下对不同浓度甲醇的降解能力。

2 结果与分析 2.1 菌株4311的鉴定

2.1.1 菌株4311菌落及细胞形态观察

通过反复传代筛选，最终从7个土样中筛选出能在1.5%（V/V）甲醇为唯一碳源无机盐固体培养基平板上快速生长的菌株共16株，并保存于斜面培养基上。每个菌株保存3份，共计48份。 4311为从第三批4号土样中筛选出的1号菌株。将斜面保存的4311菌株在以1.0%（V/V）甲醇为唯一碳的无机盐固体培养基平板上划线分离源，并在34°C培养3至5天。观察菌株4311的菌体及菌落形态。结果见图1。

图1 菌株4311的菌落(A)和细胞(B)形态

图1 4311的(A)和电池(B)

从图1A可以看出，菌株4311的菌落呈白色、圆形，直径2～3mm，中心凸起，边缘整齐，表面光滑湿润。从图1B可以看出，菌株4311革兰染色阴性，光学显微镜下观察呈短棒状。

2.1.2 4311菌株生理生化检测

菌株4311可以在以甲醇和甲胺为唯一碳源的无机盐培养基上生长。它在LB培养基上生长得更好。对链霉素和卡那霉素敏感，对氨苄青霉素不敏感，不产生色素，可产生吡咯喹啉醌PQQ，在pH值为5的培养基上能生长，当NaCl含量>1.00%时几乎不生长。菌株4311的部分生理生化测试鉴定结果见表1。

表1 菌株4311生理生化检测鉴定结果

4311的表1

注：“+”表示结果为阳性； “-”表示结果是否定的。

2.1.3 菌株4311的分子生物学鉴定

从图2可以看出，以细菌基因组DNA为模板，以27F和1492R序列为引物，扩增出的16S rDNA碱基片段大小约为1.5 kb。对16S rDNA片段序列进行测序，并将测序结果提交至NCBI数据库。使用BLAST工具进行同源性比较。结果显示，4株菌株与菌株4311具有99%的序列同源性。其中同源性超过98%的有近20个种，其中甲基球菌属有15个菌株（），属于不同种。其中最多的是4个。菌株4311的系统发育树如图3所示。从图3中可以看出，菌株4311与IM1和2395A的相似度最高，均为99%。与同属的JZL-4、YHT-1相似度达98%。菌株 4311 和 IM1 聚集成一个分支。 。

图2 菌株4311 16S rDNA PCR扩增结果电泳图

图2 4311的16S rDNA PCR

1：菌株4311； 2：菌株5222；中号：DNA DL15 000+2 000

D 15000+2000 从上到下：15 000 bp、10 000 bp、7 500 bp、5 000 bp、2 500 bp、2 000 bp、1 000 bp、750 bp、500 bp、250 bp、100 bp。

图3 基于16S rDNA序列的菌株4311的系统发育树

图3 基于16S rDNA的4311树

综合细菌特征、生理生化特征和16S rRNA基因序列分析，将菌株4311鉴定为甲基囊藻属( sp.)。分配（）。

2.2 甲醇标准曲线的绘制

从图4可以看出，当甲醇体积分数在0～0.6%（V/V）之间时，甲醇体积分数与吸光度值之间的线性相关性良好。其标准曲线线性回归方程为y=3.058 4x-0.071 4，相关系数R2=0.993 4。

图4 甲醇标准曲线

图4 曲线

2.3 不同因素对菌株4311生长及甲醇降解条件的影响

2.3.1 不同甲醇体积分数对菌株4311生长及甲醇降解的影响

从图5A可以看出，当甲醇体积分数<2.0%时，菌株4311基本不生长。当甲醇体积分数为1.0%～1.5%时，菌株的生长峰相似，约为0.7。当甲醇体积分数为1.0%时能较快进入对数相；当甲醇体积分数为0.5%时，前40 h生长速度较快，40 h后生长速度减慢，说明0.5%的甲醇体积分数在生长后期无法提供足够的量。细菌生长的碳源。从图5B中可以看出，在甲醇体积分数为0.5%的培养体系中，50~80 h培养基中甲醇含量显着下降，菌株4311在此期间处于对数生长期。对碳源的需求量大；当甲醇体积分数为1.0%和1.5%时，也存在甲醇含量急剧下降的过程，且该时间范围对应于对数生长阶段；对于甲醇体积分数为2.0%的培养体系，几乎没有降解。综合菌株生长和甲醇降解能力可知，菌株生长的最佳甲醇体积分数为1.0%。

图5 不同甲醇体积分数对菌株4311生长(A)和甲醇降解(B)的影响

图5 4311的(A)和(B)

2.3.2 不同初始pH值对菌株4311生长及甲醇降解的影响

从图6A可以看出，与其他pH值相比，菌株4311在初始pH值为5.0时生长最好。在其他pH值下细菌生长明显减弱。初始pH值为9.0时，细菌生长受到显着抑制。可能与细菌本身分泌碱性物质中和酸性介质有关，导致细菌在前20 h内所有pH梯度下均能生长，但初始pH 5.0条件下菌株生长受到抑制，慢慢地长大。 40 h后，细菌分泌的碱性物质增多，导致培养基的初始pH值越来越大。初始pH值为5.0的菌株继续生长，而其他条件下的菌株生长受到抑制。从图6B可以看出，对于菌株4311来说，当初始pH值为5.0～9.0时，甲醇降解速率随着pH的升高而逐渐降低。当初始pH值为5时，甲醇降解速度最快，降解速度最快。最彻底的。根据菌株的生长和甲醇降解能力，菌株4311生长的最佳初始pH值为5.0。

图6 不同初始pH值对菌株4311生长（A）和甲醇降解（B）的影响

图6 4311 (A)和(B)的pH值

2.3.3 不同NaCl添加量对菌株4311生长及甲醇降解的影响

从图7A可以看出，当NaCl质量分数为0.05%时，菌株4311生长最好；当NaCl质量分数为0.50%时，生长状况为第二；当NaCl质量分数>1.00%时，细菌活性极低。基本没有增长。从图7B可以看出，当NaCl质量分数为0.05%时，菌株4311对甲醇的降解能力最强，当NaCl质量分数为0.5%时，降解能力次之。这表明，随着盐度的增加，菌株4311的生长条件变得更差，导致降解甲醇的能力变差。所选的甲醇利用菌4311耐盐性差，当NaCl质量分数>1%时不能正常生长。根据细菌的生长和甲醇的降解能力，氯化钠的最佳质量分数为0.05%。

图7 不同NaCl质量分数对菌株4311生长(A)和甲醇降解(B)的影响

图7 (A)和(B)上的NaCl质量

2.3.4 不同氮源对菌株4311生长及甲醇降解的影响

氮源可用于合成细菌体内的各种有机物，对细菌的生长起着极其重要的作用。不同的氮源对细菌的影响不同。从图8A可以看出，当使用蛋白胨作为氮源时，菌株4311生长最快，其次是硫酸铵和硝酸钾，在尿素中生长最慢。推测4311菌株可能体内脲酶分泌量低，不能很好地利用尿素。作为氮源，相应地，当使用蛋白胨作为氮源时，菌株4311的生长速度最快，降解能力最强。申守国等. [26]筛选出一株甲醇降解菌，其最佳氮源为蛋白胨，其次为硫酸铵，且在硝酸钾中不生长。结论与本研究相似。

图8 不同氮源对菌株4311生长(A)和甲醇降解(B)的影响

4311的(A)和(B)图8

2.3.5 不同氮源添加量对菌株4311生长及甲醇降解的影响

从图9A可以看出，蛋白胨添加量在0～10g/L范围内。蛋白胨添加量越高，细菌的生长速度越快；当以10 g/L蛋白胨为氮源时，该菌96 h的值可达到1.1左右。培养过程中，以硫酸铵为氮源时，培养4天后，培养基中的细菌细胞就会在溶液中聚集。但当使用蛋白胨作为氮源时，细菌聚集会延迟1～2天。 。从图9B可以看出，当蛋白胨添加量为2 g/L时，菌株4311的降解能力最强。当蛋白胨添加量为0.5 g/L时，降解能力略次之。当蛋白胨添加量为10 g/L时，菌株4311生长状况最好，但降解能力最差。原因可能是蛋白胨含有碳源，与甲醇竞争，影响甲醇的利用率。根据菌株的生长情况和甲醇降解能力，蛋白胨的最佳添加量为2 g/L。

图9 不同蛋白胨添加量对菌株4311生长(A)和甲醇降解(B)的影响

4311的(A)和(B)图9

3 结论

本研究从义马气化厂甲醇车间附近土壤中筛选得到一株甲醇利用细菌4311。通过对该菌株16S rDNA序列分析，结合其形态和生理生化特征，将菌株4311鉴定为甲基球菌属( sp.)。生长特性研究表明，该菌株的最佳生长和降解条件为甲醇体积分数1.0%、初始pH值5.0、氯化钠质量分数0.05%，最佳氮源为蛋白胨，添加量为2 g/L。在这些最佳培养条件下，1%（V/V）甲醇的降解率可达85%。

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