酶催化降低反应活化能的机理及静电催化作用

酶催化降低反应活化能的机理及静电催化作用

酶催化降低反应活化能的机理 邻近效应（）与定向排列（）： ：发生反应的两种分子与酶结合后，处于邻近接触状态，不需要通过随机碰撞而靠近（相当于提高了局部反应物的浓度）； ：反应物分子与酶结合后，不仅彼此接近，而且处于对反应最有利的取向，不需要在碰撞中调整反应分子间的取向。 第29页，共60页。 静电催化（） 底物与酶结合后，活性中心（）内通常没有水分子，活性中心局部介电常数变低，静电作用增强，使水分子不能接触活性基团，保护了活性基团，防止水与活性基团反应生成副产物。如果水是底物，酶有办法让水进入活性中心。 此时水分子可能存在于活性的某个位置。酶中的带电基团可以稳定反应中产生的带电中间体，通常这些中间体是不稳定的。酶催化降低反应活化能的机理。第30页，共60页。酶催化降低反应活化能的机理是利用结合能来稳定过渡态。降低活化能是酶催化过程中降低活化能的最重要机制。酶与过渡态的结合比与底物或产物的结合要紧密得多，从而降低了活化能，提高了反应速率。第31页，共60页。

酶活性概念 酶活性就是酶催化反应的能力。酶活性是指在一定条件下催化化学反应的快慢，即酶催化的反应速度越快，酶活性越高，反之越低。酶的定量不是对其蛋白质进行定量，而是对其催化能力进行定量。因此，酶的定量就是测定酶的活性，也就是测定酶催化反应的快慢。 第32页，共60页 如何测定酶活性？ 将产物浓度与反应时间作图，可得到酶催化反应速度曲线 0 产物浓度 时间 注意：初速度的确定是关键，为什么？ 第33页，共60页 如何测定酶活性？ 可以看出，反应速度只在最初的一段时间内保持不变。 随着时间的推移，反应速度逐渐降低 产物浓度 时间 0 原因 底物浓度降低，产物增多，引起逆反应加快 产物的抑制 酶本身逐渐失活 第34页，共60页 酶活力测定要点 底物浓度：测定酶活力时，要求[S]达到一定的水平，以保证酶活力与酶量成正比，[S]一般在10-20km范围内选取，此时反应速率基本达到最大反应速率，测量误差在可以接受的范围内。 酶浓度：在反应条件一定时，酶浓度与反应速率成正比，根据中间产物理论，只有当[S][E]时，酶才能被底物分子饱和，反应速率才能达到最大值。

因此当样品酶活力过高时，应适当稀释样品后再测定。反应条件：酶活力测定要在最适宜的条件下进行，即最适宜的温度、最适宜的pH、最适宜的底物浓度和最适宜的缓冲离子强度。只有在最适宜的条件下，才能真实的反映酶活力。第35页，共60页。反应时间：通常要求底物浓度足够大，以测定底物浓度在初始浓度5%以内变化的速率，这样才能保证测得的速率为初始速率，这样的结果能更可靠的反映酶含量。辅因子：有些金属离子和维生素辅酶是与酶结合的辅因子，这些酶如果没有其辅因子或辅酶就不能表现出活性，因此，测酶活力时，必须保证辅因子或辅酶的供应。激活剂：有些酶只有有激活剂存在时才有活性或活性较高。 因此测定酶活力时，还必须满足酶对激活剂的需要。 抑制剂：抑制剂会降低酶活力，测定酶活力时，应避免抑制剂的影响。 第36页，共60页。 3.生物催化的技术特点 生物催化的性能 生物催化的优点 生物催化的缺点 生物催化的用途 第37页，共60页。 催化剂性能指标 活性 选择性 稳定性 生物催化剂 第38页，共60页。 活性 总酶活力：国际酶单位（IU）或酶单位（U） 1单位≡1 IU≡1 U≡1μmol·min-1 比活力：单位质量催化剂的活性，评价催化剂性能的基本指标 1U·mg -1=1μmol·（min·mg ）-1 *优质的生物催化剂，其比活力至少为1U mg -1。 当用于工业规模时，其比活度必须更高，甚至接近蛋白质-1第39页，共60页。

活性体积活度：单位体积催化剂的活性1U·ml-1=1μmol·(min·ml)-1 转化频率：每个活性位点每秒可发生的催化事件数，优于比活度，与酶量无关，对于遵循米氏方程的酶反应，tof=1/kcat 转化频率（tof）=催化事件数·时间×活性点数Tof= 第40页，共60页。 选择性 目标产物分子的光学纯度和生物催化剂在实现这一目标方面的独特优越性的重要性，对映选择性是生物催化剂选择性研究中最重要的一项 对映选择性（E值）：可以衡量在一定转化程度下的对映选择性 Chen CS JACS, 1982, 104, 7294-7299 对映体过量（ee）：产物分离后总选择性的大小 第41页，共60页。 稳定性 酶稳定性：通常指温度稳定性，以变性温度Tm为特征。在特定温度、pH及添加剂条件下的贮存稳定性，可用衰减模型来表示： 操作稳定性/工艺稳定性： 可用酶消耗数（，），即生产一定量产品所需的酶量： 当知道生物催化剂的纯度时，可用总转化数（total，TTN），即生成的产品量与消耗的生物催化剂量来表示： *对于合成工艺，TTN应大于10000。对于大规模加工，TTN最好大于42页，共六十页。

生物催化的优势 无与伦比的选择性 当使用酶来增强反应的化学选择性或区域选择性时，酶的最大优势在于它们能够区分对映体底物。R 异构体和 S 异构体之间的吉布斯自由焓 ΔGRS 差异仅为 1-3 kJ/mol。使用酶通常可以实现超过 99% ee 的对映选择性。酶的高对映选择性在高级药物中间体的合成中变得越来越重要，其中监管机构要求对超过 1% 杂质含量的杂质进行毒性测试。 第 43 页，共 60 页 非常温和的反应条件 酶的反应条件非常温和，可以在室温、中性 pH 值和水相中激活，这在今天被认为是优点而不是缺点。 “可持续发展”、“绿色化学”、“环境友好型制造”等工业发展目标对全球大部分地区的工业提出了新的要求。如果没有能够耐受这些条件的生物催化剂，这一目标很难实现。 第 44 页，共 60 页 酶催化反应日益增多 生物催化剂能够进行的反应越来越多。这反映在工业规模上生物催化剂的使用日益增多。而且，生物催化剂越来越多地与化学催化剂结合使用或用于细胞内的反应网络。 第 45 页，共 60 页 生物催化的缺点 在必要的反应介质中，生物催化剂不够稳定。可以通过蛋白质工程和酶工程提高稳定性。 在将可用底物转化为目标产物时，适合所需反应的生物催化剂并不多。随着生命科学的发展，生物催化剂的数量大幅增加。开发新的和改良的生物催化剂的周期太长。 随着生物工程和生物催化研究的不断深入，这个周期必然会缩短。第 46 页，共 60 页。

生物催化在工业上的应用，掀起了生物技术的第三次浪潮！ 微生物学 分子生物学 酶学 生物化学 有机化工过程 化学动力学 反应工程 反应器设计 化学品 纸和纸浆 植物保护 动物饲料 食品、营养 制药工业 生物技术 生物催化 医学诊断 分析 采矿 生物产业被列为国家七大战略性新兴产业之一 第 47 页，共 60 页 4.生物催化的起源与发展 生物催化发展简史 生物催化应用现状 生物催化的主要障碍 生物催化发展的机遇 第 48 页，共 60 页 生物酶催化反应发展史 1906 年，（）利用肝脏提取物水解外消旋亮氨酸丙酯制备L-亮氨酸。1926 年，（）从刀豆中分离、纯化了脲酶晶体。 1952年（ ）发现黑根酶能将孕酮转化为α-羟基孕酮，且产品收率高、光学纯度好，解决了甾体药物合成中的重大难题。1867年Kuhne提出用酶（ ）来描述催化活性。1897年等发现活酵母细胞提取物也有发酵作用，能将葡萄糖转化为乙醇和二氧化碳，为现代酶学研究奠定了基础。1916年和发现蔗糖酶与骨炭粉结合后仍有酶活性。

巴斯德（）是手性化合物研究的先驱，1848年他从外消旋酒石酸铵钠晶体混合物中分离出（+）和（-）两晶体酒石酸铵钠。1894年，菲舍尔（）提出“锁与钥匙理论”来解释酶作用的立体特异性。1908年，罗森堡（）利用杏仁（D-醇氰酶）作为催化剂，合成了光学活性的氰醇。这些创造性工作推动了生物酶催化不对称合成的研究和发展。1936年，塞姆（Sym）发现胰脂肪酶在有机溶剂苯存在下，仍能提高酶催化酯合成。1960年，通过地衣芽孢杆菌（）深层培养发酵大规模制备蛋白酶，开始了酶的商业化生产。 1984年，他开创的在非水介质中酶反应的研究，极大地推动了酶在有机合成中的应用。20世纪80年代初，切赫和保罗分别发现了具有催化功能的RNA（），从而打破了所有酶都是蛋白质的传统观念，开辟了酶学研究的新领域。经过近半个世纪的研究，生物催化不对称合成已成功应用于光学活性氨基酸、有机酸、多肽、甾体转化、抗生素修饰及手性原料的制备，成为一种标准的有机合成方法。

第49页共60页 生物催化应用现状2002年报告涵盖了134个规模在100kg以上的工业级生物转化(Curr. Opon. ., 2002, 13, 548-556) 第50页共60页 手性药物的迫切需求促进了生物催化的发展。20世纪90年代，手性药物的研究开发已成为世界新药开发的战略方向和热点领域。不对称催化反应研究的成功给手性药物产业注入了强大的活力。2001年的诺贝尔化学奖授予了三位从事不对称催化反应的科学家。酶催化是获得光学纯手性药物的关键技术。 Ryoji “我们为我们的高质量产品感到自豪” —— Ryoji 第 51 页，共 60 页 全球单一对映体药物销售额持续快速增长。 第 52 页，共 60 页 生物催化对手性产业的贡献 年份 传统技术（手性来源和分离） 化学催化 生物催化 2002 55% 35% 10% 2005 49% 36% 15% 2009 41% 36% 22% （新闻，2006 年） 第 53 页，共 60 页

美国的目标是通过生物催化技术，到2020年使化学加工工业的原材料、水资源和能源消耗减少30%，污染物的排放和扩散减少30%。日本政府自2001年起也制定并实施了“以生物功能为基础的循环工业体系创建”计划，发展用于生产化学物质的细胞系统。 第54页，共60页。 第1章 引言 第1页，共60页。 摘要 1.生物催化的学科基础 2.生物催化的基本概念 3.生物催化的技术特点 4.生物催化的起源和发展 第2页，共60页。 （1）资源危机：化石资源——不再生资源 （2）能源危机：化石燃料——不可再生能源 （3）环境危机：三废排放——环境污染 以化学催化为核心的基础材料加工工业面临潜在危机 第3页，共60页。 地球化学演化 地球化学循环 人类物质文明 认识和利用自然规律，发展人工生物催化技术，实现化学加工工业的可持续发展 基础材料加工业模仿自然，发展清洁高效的生物制造（趋势） 生物制造 生物催化剂 生物资源 天然生物催化与转化 潜力巨大 生物催化与生物转化是解决材料加工危机的有效途径之一。 第 4 页，共 60 页 生物催化的定义 生物催化与转化是利用细胞或酶作为催化剂，将物质进行转化，大量生产化学品、药物、能源和材料的一门技术科学。

具有高效、高选择性、低污染等特点。OECD指出“生物催化是可持续工业发展最有前途的技术”。 第5页，共60页。 第6页，共60页。 目前，如何利用微生物丰富的酶系统和基因资源，将地球表面丰富、可再生的大量木质纤维素原料有效转化为人类社会有用的生物质能源和生物基化学品和材料，已成为新一代工业生物技术研究的热点问题。 第7页，共60页。 生物催化的学科基础 生物催化与化学催化 生物催化与发酵技术 生物催化与化学工程 第8页，共60页。 生物催化是一门典型的交叉学科 化学生物学 化学工程 生物催化 微生物学 分子生物学 酶学 生物化学 有机化学 动力学 反应工程 反应器设计 第9页，共60页。 生物催化与化学催化 生物催化与化学催化的工作原理相同。 酶可以催化有机化学中几乎所有的反应。酶创造更温和更优越的反应条件 第 10 页，共 60 页。反应 EC 编号 酶 - 还原 酒精脱氢酶 酒精脱氢酶 拜耳-氧化 2 拜耳-单加氧酶 醚键断裂 甘油醚酶 歧化反应 过氧化物歧化酶 转氨作用 2.6.1.x 氨基转移酶 水解 3.1.-.- 脂肪酶，酯酶 磷酸水解/1 酸性/碱性磷酸酶 酯化反应 4 枯草杆菌蛋白酶 酯交换反应 4 枯草杆菌蛋白酶 肟化反应 脂肪酶 … … … 酶可以催化有机化学中几乎所有的反应 第 11 页，共 60 页。

CmHn N源产物发酵底物 N源生物转化底物产物前体发酵底物 酶催化 生物催化 生物催化与发酵技术 第12页，共60页 生物催化与发酵技术 发酵：利用一些含有糖和淀粉的工业原料如糖蜜或玉米作为碳源，通过活细胞发酵可以生产出更复杂的目标产物 前体发酵：利用活细胞将特定的前体转化为目标产物 生物转化：利用酶或静息细胞通过一系列步骤将前体转化为目标产物 酶催化：通常使用粗酶或部分纯化的酶将底物转化为目标产物。除非用于生产高附加值的精细化学品，否则很少使用纯酶。 第13页，共60页 生物催化与化学工程 化学工程侧重于反应及其过程特性，研究传质、传热和传递现象。酶反应工程的主要目标是在高化学选择性和高对映选择性下实现高时空产率和高底物转化率。 酶催化反应中存在底物扩散、抑制、反应器设计等问题，其解决需要参考化工理论 SP Ks Kp SPE 第14页，共60页。2.生物催化的基本概念 酶的分类与命名 酶催化的机理 酶活性的测定方法 第15页，共60页 酶的种类及命名规范 命名规范 底物名称+“酶” 如己糖激酶、蛋白酶、脲酶 反应类型+“酶” 如己糖激酶、乳酸脱氢酶、DNA聚合酶 酶源 如胃蛋白酶？这种习惯性的命名规范缺乏科学的系统性，容易出现“一酶多名”或“一名多酶”等问题。

第 16 页，共 60 页 酶的种类与命名 国际系统命名法 此系统规定每一种酶的名称应清楚地表明底物和它所催化的反应的特征，即酶的名称应包含两部分：前面是底物，后面是它所催化的反应的名称。 第 17 页，共 60 页 酶的种类与命名 第 18 页，共 60 页 酶的种类与命名 根据1961年酶委员会第一次报告，所有酶根据其催化的反应分为六大类。 按照分类，每种酶都有一个编号（“EC”代表“酶学委员会”） EC abc d 酶类 酶亚类 酶亚亚类 酶序列号 第1大类序列号 作用 CHOH NAD+作为受体 例如：EC 酒精脱氢酶 第19页，共60页 酶的种类和命名法 国际酶委员会（EC）根据酶催化反应的性质，将所有酶分为六大类。 第20页，共60页 酶的活性中心：酶分子上具有特定空间结构的区域，能与底物特异地结合，起催化作用。 活性中心 催化基团 结合基团 调节基团 中心内的必需基团 中心外的必需基团 第21页，共60页 酶的活性中心 催化基团 活性中心 底物分子 结合基团 第22页，共60页

酶活性中心结合基团（基团） 酶分子中能与底物结合，并与底物和酶的一定构象形成复合物的基团。酶的结合基团决定了酶反应的专一性。第23页，共60页。 酶活性中心催化基团（基团） 酶分子中能催化底物的化学反应，并将其转化为产物的基团。催化基团决定了酶催化反应的性质。第24页，共60页。 酶活性中心调节基团（基团） 酶分子中能在一定程度上与其他分子结合，引起酶分子空间构象的改变，激活或抑制酶的某些基团。第25页，共60页。 酶催化动画第26页，共60页。 酶催化降低反应活化能的机理第27页，共60页。 酶催化降低反应活化能的机理动画第28页，共60页。 * *近年来，建立在大量消耗化石资源基础上的现代制造业的飞速发展，大大提高了人们的物质生活水平，但也不可避免地对人类赖以生存的地球生态系统构成了严重威胁。仅在过去一百年里，人类就消耗掉了地球上储存了数百万年但短时间内难以再生的化石资源（石油、煤炭、天然气）的很大一部分，并向大气中排放了巨量的温室气体（CO2）和其他对环境有害的物质（如SO2、NOx等），对人类自身的可持续发展构成了严峻挑战。

在此历史背景下，科学家们再次将目光聚焦到地球物质循环的幕后操纵者——生物催化与生物转化系统上。进入新世纪，随着石油资源日益枯竭，全球气候变暖已成为不争的事实，以可再生生物质（碳水化合物）资源为原料，反应条件温和、特异性强的生物催化过程将逐渐取代一些高度依赖石油资源（碳氢化合物）或需要高温高压、强酸强碱、选择性差的传统化工过程，即所谓的原料替代或工艺替代。也就是说，随着石油价格的不断上涨，未来大宗能源、材料和化学品将越来越多地转向相对廉价、可再生的生物基原料。而产品的合成过程将尽可能采用高选择性、环境友好的生物过程，或将化学转化与生物转化进行优化组合、有机整合。 由于酶所固有的立体专一性，生物催化与生物转化技术特别适合于解决化学合成药物和农药中常见的无效甚至有害的对映体的手性转化问题。非水相生物催化技术的突破为许多水不溶性底物的生物转化，特别是人工合成的外消旋混合物的对映选择性反应提供了广阔的前景。生物催化的任务不仅是有效地利用自然，而且是巧妙地改造自然，使自然界中的酶与物质进行新的组合、改造，合成人类生活和社会活动所需的各种有用物质和材料。

生物催化工程（ ）是研究如何高效开发和利用生物催化剂大规模生产能源、材料、医药、农药等大宗或精细化学品的一门工程科学。当前，如何利用微生物丰富的酶系统和基因资源，将地球表面丰富、可再生的大量木质纤维素原料有效转化为人类社会有用的生物质能源和生物基化学品和材料，已成为新一代工业生物技术研究的热点问题。生物催化与生物转化技术已作为新一代工业生物技术的主体被列入2006—2020年国家中长期科技发展规划纲要。生物催化的任务不仅在于有效利用自然，而且在于巧妙地改造自然，使自然界中的酶与物质进行新的组合、改造，合成人类生活和社会活动所需要的各种有用物质和材料。 生物催化工程（ ）是研究如何高效开发和利用生物催化剂大规模生产能源、材料、医药、农药等大宗或精细化学品的一门工程科学。当前，如何利用微生物丰富的酶系统和基因资源，将地球表面丰富、可再生的大量木质纤维素原料有效转化为对人类社会有用的生物质能源和生物基化学品与材料，成为新一代工业生物技术研究的热点问题。生物催化与生物转化技术已作为新一代工业生物技术的主体被列入2006—2020年国家中长期科技发展规划纲要。不同学科的人可以从不同的角度看待生物技术和生物催化，化学和化学家强调分子角度，以化合物和转化反应为中心；而化学工程和化学工程师则更注重反应及其过程； 生物学和生物学家从系统的角度看待生物催化，侧重于对生物体水平及其进化过程的描述。要成功地应用生物催化，需要结合上述三个学科的不同部分：生物化学来自化学；分子生物学、酶学和蛋白质生物化学来自生物学；催化、传质现象和反应工程来自化学工程。生物工程和生物催化都是交叉学科；大多数研究者主要研究上述三个学科中的一门，几乎没有人能同时掌握生物催化的所有子学科。每当有人提出生物催化的原理是否与有机催化相同的问题时，人们在仔细分析后，得出的结论是，两者并无区别。酶的催化机理并无不同，但催化性能更优。许多酶催化模型证明，酶的催化行为可以得到更合理的解释。酶还能创造更温和、更优越的反应条件。人们发现，酶可以催化有机化学中几乎所有的反应。 生物技术转化包括的过程非常广泛，根据生化反应步骤的多少和底物的复杂程度，生物技术转化可分为以下几类。1.发酵，利用一些工业原料如糖蜜或含有糖和淀粉的玉米等作为碳源，用活细胞进行发酵，可以生成抗生素等较为复杂的目标产物。2.前体发酵，利用活细胞将特定的前体转化为目标产物。3.生物转化，利用酶或静止细胞通过一系列步骤将前体转化为目标产物。4.酶催化，通常利用纯酶或粗酶将底物转化为产物。21世纪初，随着人类基因组图谱的绘制完成，我们迎来了生物学和生物技术飞速发展的新时代。

这必然会对生物催化和生物转化的发展产生革命性的影响。工业生物催化技术被视为继农业和医药生物技术之后生物技术发展的第三次浪潮。与此相应，工业界出现了两个明显的发展趋势：一方面，化学工业公司雇佣越来越多的生命科学家；另一方面，有机化学家在面对新的或更困难的合成任务时，开始把生物催化视为一种有效的合成工具。这将使生物催化剂获得更多的工业应用。几年前，工业级的生物催化应用很少，但随着越来越多新技术的出现，生物催化的研究和向大规模应用的拓展越来越迅速。2002年，在一篇关于生物催化工业应用现状的综合报告中，工业规模的生物催化被提及的数量是过去十年的两倍多。在134个工业生物转化中，规模都在100KG以上。 主要的是水解酶（44％）和氧化酶（30％） 公司希望原材料供应商能够应对手性的挑战，因为可以通过多种方式来完成手学合成的精美化学公司，例如手学源技术，手势色谱，化学或生物学分离，生物学不对称合成和化学效果，这是必不可少的。

原因之一是对生物催化的持续增长Zyme是开发的，其运营成本通常更高，而对于某些“一锅”的串联反应，相关酶可以在静止细胞中融合在一起，因此，由于这些原因，生物催化是在未来的70亿美元中，从2002年的 （ ）（）（）（）（）（ 3）（）（）3％（）（）（）（）（）（）3％。放电分析。 该调查报告预测，单一对映异构体的全球收入将在2004年达到857亿美元，年增长率为11.4％； 2005年，它将达到95亿美元，其中49％的人将通过手性能和分离技术产生的全球范围。产品将增加到149.4亿美元，其中传统技术的贡献率将下降到41％，化学催化技术的份额将保持在36％左右，而生物催化技术的贡献率将进一步攀升至22％。

原因之一是对生物催化的持续增长Zyme是开发的，其运营成本通常更高，而对于某些“一锅”的串联反应，相关酶可以在静止细胞中融合在一起，因此，由于这些原因，生物催化是在未来的70亿美元中，从2002年的 （ ）（）（）（）（）（ 3）（）（）3％（）（）（）（）（）（）3％。放电分析。 该调查报告预测，单一对映异构体的全球收入将在2004年达到857亿美元，年增长率为11.4％； 2005年，它将达到95亿美元，其中49％的人将通过手性能和分离技术产生的全球范围。产品将增加到149.4亿美元，其中传统技术的贡献率将下降到41％，化学催化技术的份额将保持在36％左右，而生物催化技术的贡献率将进一步攀升至22％。

在过去的5至10年中，在生物催化中发生了一些重大变化，使得化学家更容易接受，而Tao 是BMS组的负责人N. Patel，许多其他学者都指出，如果没有这些进步，就不可能进行这些进展。生物催化，廉价的测序技术是由基因组学和蛋白质组学的发展带来的，并指示进化技术进行优化[28]。获得了Alyst，通常只需要一到三个月才能完成过程开发。 一旦发现了生物催化剂，尽管有许多方法可供选择，但Tao 认为底物调节和反应工程通常可以比定向进化更快地克服障碍。