山东大学生命科学学院 08 级生命基地碱发性提叏法提取质粒 DNA 实验报告

山东大学生命科学学院 08 级生命基地碱发性提叏法提取质粒 DNA 实验报告

山东大学生命科学学院08级生命基地，2010年10月31日星期日 【质粒DNA提取】【碱变性提取法】【鸾仪】【第1号】三大南路27号] 质粒DNA的提取——碱变性提取法2/17 质粒DNA的提取——碱变性提取法 实验目的： 1、掌握碱提取的原理和各种试剂的作用。 2．掌握碱法提取质粒DNA的方法。仪器和材料；恒温振荡培养箱、高速离心机、涡旋振荡器； 1.5ml离心管、50ml离心管；不同类型的枪尖等。 细菌：E. alpha 噬菌体、带有 AMpr 标记的质粒 PUC19。实验试剂：LB培养基、抗生素、溶液I、溶液II、溶液III、母液、TE缓冲液、饱和苯酚等。 测试原理：碱裂解法是较常用的质粒提取方法。其优点是收获率高，适合大多数菌株。所得产物纯化后可满足大多数DNA重组操作。该方法简单、易操作，一般实验室即可进行。十二烷基磺酸盐用于质粒小量制备。十二烷基硫酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，可以裂解细菌细胞并使某些蛋白质变性。用 SDS 处理细菌会导致细菌细胞破裂并释放质粒 DNA 和染色体 DNA。两种类型的DNA在强碱性环境中都会变得活跃。由于质粒与主染色体的拓扑结构不同，前者的两条链虽然分开，但仍然缠绕在一起，并未分开；但后者则完全分解甚至破碎。因此，当加入酸性pH 4.8时，当醋酸钾降低溶液的pH值并使其恢复到较低的接近中性水平时，质粒DNA提取-碱性变性提取方法3/17，两条小分子单链质粒可以快速复性并恢复双链结构，但主染色体DNA很难复性。

离心过程中，大部分主染色体沉淀下来，不与细胞碎片、杂质等纠缠在一起，而可溶性质粒DNA则保留在上清液中。然后，通过异丙醇沉淀和乙醇洗涤即可获得纯化的质粒DNA。碱裂解法提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析等。粗DNA提取使用三种溶液：溶液I，50mM葡萄糖/-Cl/，pH8.0；溶液I，50mM葡萄糖/-Cl/，pH8.0；溶液II，0./1% SDS；溶液III，3M乙酸钾/2M乙酸；溶液一：对于任何生化反应，首先必须控制溶液的pH值，因此使用适当浓度和pH值的Tris-Cl溶液，这是绝对自然的。添加葡萄糖后最大的优点是悬浮的大肠杆菌不会很快沉降到管底。因此，如果溶液I中缺乏葡萄糖，对质粒提取本身几乎没有影响。因此，溶液 I 中缺少葡萄糖。EDTA 是二价金属离子（例如 Ca2+ 和 Mg2+）的螯合剂。其在分子生物学试剂中的主要作用是抑制DNase的活性，抑制微生物的生长。在溶液 I 中添加 10mM EDTA 无非是螯合大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子。如果不添加EDTA，只要短时间内完成质粒提取，就不用担心DNA会很快降解，因为TE 中有EDTA，最终会溶解质粒。

如果缺少溶液 I，只需使用等体积的水或 LB 培养基来悬浮细菌。但细菌必须悬浮均匀，不能结块。质粒 DNA 提取 - 碱变性提取方法 4/17 溶液 II：使用新鲜的 0.4N NaOH 和 2% SDS 等体积混合。用浓NaOH制备0.4N NaOH的目的是保证NaOH不吸收空气中的CO2而削弱碱性。事实上，破坏细胞的主要是碱，而不是SDS，所以称为碱提取法。事实上，NaOH 是裂解细胞的最佳试剂。无论是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，它们在接触碱时几乎会立即溶解。这是由于细胞膜从（双层膜）结构转变为（微生物膜）所致。由胶囊）结构的相演化引起。如果使用stale 0.，即使是SDS也无法有效溶解大肠杆菌，自然难以高效提取质粒。当然，如果只用SDS，可以提取少量质粒，因为SDS也是碱性的，只是弱一点。这一步要记住两点：一是时间不能太长，因为基因组DNA片段在这样的碱性条件下会慢慢断裂；二是时间不能太长。其次，混合一定要轻柔，否则基因组DNA也会断裂。基因组 DNA 的断裂可能会带来麻烦。方案三：添加后会产生大量沉淀。大量沉淀的出现显然与SDS的添加无关。如果溶液 II 中不添加 SDS 会发生什么？也会有少量降水，但量要小得多。显然是盐析、酸化后沉淀出的蛋白质。

缓慢将 5N NaCl 添加到 1% SDS 溶液中。您会发现 SDS 在高盐浓度下会沉淀。因此，高浓度的盐会导致 SDS 沉淀。但如果添加KCl而不是NaCl，你会发现沉淀量要大得多。这实际上是十二烷基硫酸钠()遇到钾离子并变成十二烷基硫酸钾(ate，PDS)。 PDS不溶于水，因此会产生沉淀。从这个角度来看，加入溶液III后的沉淀实际上是钾离子取代了SDS中的钠离子，形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐使沉淀更加完全。 SDS 喜欢与蛋白质结合。平均而言，一个 SDS 分子与两个氨基酸结合。钾、钠离子置换引起的大量沉淀自然沉淀出大部分蛋白质，大肠杆菌的基因组DNA也被共沉淀。由于基因组DNA太长，长DNA自然很容易被SDS共沉淀，尽管SDS不与DNA分子结合。那么为什么要添加2M乙酸呢？就是中和NaOH，因为长期的碱性条件会打断DNA，所以必须中和。基因组DNA一旦片段化，只要片段大小为50-100kb，就不再被PDS共沉淀。因此，碱处理时间应短，且不宜剧烈晃动。否则，最终的质粒中总会混入大量的基因组DNA，并且在琼脂糖电泳中可以观察到较粗的总DNA条带。

DNA分子可溶于中性溶液。 NaOH最初用于溶解细胞。 DNA分子的退化实际上是一种副产品。是否沉淀并不重要。加入溶液 III 并混合均匀，然后将其置于冰上。目的是让SDS沉淀得更充分。测试准备： 1.溶液I：pH8.0 GET （葡萄糖，/LEDTA，/LTris-HCl）； 2、溶液二：0.2mol/LNaOH（含1%SDS），需立即配比使用。溶液II是新配制的，以防止NaOH与空气中的CO2接触而减弱碱性。 3、溶液III：pH 4.8的醋酸钾溶液(60ml 5mol/L KAc，11.5ml冰醋酸，28.)；质粒DNA提取——碱变性提取法6/174，异丙醇；使用PEG(6000)沉淀DNA，不同大小的DNA分子所用的PEG浓度也不同。 PEG浓度低，选择性沉淀的DNA分子量大。大分子所需的PEG浓度仅为1%左右，小分子所需的PEG浓度高达20%。 。 5、pH8.0TE缓冲液；/LTris-HCl，1mmol/L EDTA，含RNase 20ug/ml。实验步骤 1、准备LB液体培养基、灭菌枪头（/200ul/20ul）、两个50ml离心管、吸管、锥形瓶等。

2. 将E.α接种到含有氨苄青霉素的培养基中，37℃培养过夜。 （注意无菌操作，防止杂菌干扰试验。） 3、从摇床中取出培养过夜的细菌，轻轻混匀，将2-3ml菌液转移至50ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中。培养基，37℃、160r/min振荡培养过夜或至对数生长期。 （培养一晚后，液体培养基底部变浑浊，有大量菌体沉淀。） 4、先称取50ml灭菌离心管的质量m1，然后将一定量的细菌培养液倒入离心 5 分钟，弃去上清液。液体并收集细菌。 5. 将 5 ml 用冰预处理的溶液 I 添加到沉淀中并充分混合（需要剧烈摇动）。离心5分钟，弃上清，收集细菌。将离心管倒置在干燥、冷的吸水纸上并吸干。称其质量m2。 （m2-m1 为细菌细胞的湿重。干燥后，将离心机旋转 质粒 DNA 提取 - 碱性变性提取法 7/17 管口朝下，直至看不到液滴。加入离心管前，将细菌细胞混匀添加溶液I使用时一定要打散菌泥）。 6、按照湿菌细胞量：溶液I质量=100mg：1ml的比例加入冰预处理的溶液I，剧烈摇晃，使菌体完全分离。冰浴5分钟。 （要打散细菌细胞，可以用吹吸的方法帮助溶解细菌，也可以使用涡旋振荡器，这一步主要是悬浮细菌细胞） 7、加入溶液I体积的2倍溶液II，慢慢加入翻转混合（不要剧烈摇晃！）并将离心管置于冰上 5 分钟。这时溶液就会像蛋清一样粘稠。

（加入溶液II时，要一滴一滴地加入，轻轻摇动溶液使其混合，动作要快，因为强碱不能在溶液中停留太久，也会损伤质粒DNA。如果操作慢，冰G-细胞壁较薄，强碱足以破坏细胞壁。轻轻摇动后，溶液会变得粘稠。） 8、使用1.5倍溶液。 I、冰浴后加入等体积的 III，轻轻颠倒数次混匀，使其均匀分布在粘稠的细菌裂解液中，将离心管置于冰浴中5分钟。 （加入溶液Ⅲ后，产生大量絮状沉淀，冰上静置后，沉淀沉于溶液底部。溶液Ⅲ中和强碱，使质粒复性。不要剧烈摇晃，即可放入冰上使其复性。） 9. 4°C 离心 15 分钟，将上清液放入新的离心管中。 （白色沉淀聚集在离心管的一侧，上清液澄清。取出离心管时，不要改变其倾斜度，将枪尖斜插入，不要接触下部沉淀。吸取时，计算上清液的体积。尽可能多地吸出上清液。） 10. 将 1/10 体积的 NaAc 和 2 倍体积的无水乙醇加入到上清液中，混合，并在 -20°C 下沉降 30。分钟。 （加入上述溶液后，溶液变浑浊，但浑浊程度明显小于加入溶液Ⅲ时，高浓度盐有利于质粒沉淀。） 质粒DNA提取-碱变性提取法8/1711 ，离心15分钟，小心倒出上清液，将离心管倒置在吸水纸上，让液体全部流出。

12. 将 5 ml 70% 冰冷乙醇加入 DNA 沉淀中，离心 5 分钟。 （离心管底部DNA沉淀的表面应与收集沉淀的表面一致。）除去上清液，将离心管倒置在吸水纸上。 （加入乙醇时，不要打散沉淀的洗涤盐，枪尖深入离心管，将液体推至沉淀物的另一侧，然后旋转离心管，使沉淀物离心时小心放置离心管，不要改变质粒沉降位置朝外，粗提的质粒呈浅黄色，随着水分的减少而变成无色。溶解质粒，需在离心管上标记质粒位置。） 13. 将 DNA 沉淀溶解于 1ml TE 缓冲液中，转移至试管中，加入 RNase A（纯浓度 50ug/ml），并在 30℃下孵育。 37°C 1小时。 （加入TE溶液溶解质粒时，可用600ul溶解，400ul冲洗未完全转移的质粒。吹气助溶时，用黄色吸头吸起溶液，打在质粒位置上方即可由于质粒本身有粘性，容易产生气泡，溶液快用完时，请勿将枪尖插入溶液中，并混合溶液以保温。） 14. 将上述溶液分配均匀。分入两个 1.5ml 微量离心管中。每管0.5ml，向溶液中加入等体积的饱和苯酚溶液，摇匀混匀，4℃离心5分钟，将上层水相倒入干净的冷管中。

（苯酚被Tris饱和，呈黄色。加入苯酚后，溶液分层，苯酚向下，下层呈浅黄色，上层溶液无色，中间产生大量白色沉淀，即变性后的蛋白质，通过比较两个离心管的液体高度，加入与原溶液相同体积的苯酚，加入苯酚后，将离心管放平，不要改变倾斜角度。用黄色枪尖吸出上层质粒 DNA 提取的上清液（碱变性提取法 9/17） 尽可能多地吸出上清液，但不要吸出蛋白质） 15. 加入等体积的苯酚。 /氯仿溶液（1:1）。摇匀混匀，4°C 离心 5 分钟，将上清液倒入干净的冷管中。 （此时，没有明显的