D-阿洛酮糖：蔗糖理想替代甜味剂，具有多种生理功能和开发价值

D-阿洛酮糖：蔗糖理想替代甜味剂，具有多种生理功能和开发价值

作为一种罕见的酮糖，D-阿洛酮糖是果糖的 C-3 差向异构体。其甜度相当于蔗糖的70%，能量仅为蔗糖的0.3%。它低热量、绿色、甜。它具有较高的酒精含量、与蔗糖相似的口感和体积特性，被认为是蔗糖理想的替代甜味剂[1-2]。 D-阿洛酮糖具有改善胰岛素抵抗[3]、抗肥胖[4]、调节血脂代谢[5]等多种生理功能。此外，还可以提高产品品质，如增加明胶软糖的弹性和水分含量，保持烘焙产品的湿度和硬度等[6-7]等。因此，D-阿洛酮糖作为蔗糖具有重要的开发价值替代品和食品添加剂。由于D-阿洛酮糖的极度稀缺性和良好的生理功能，如何低成本、工艺简单地大量生产D-阿洛酮糖一直是近年来的研究热点。与复杂、繁琐、收率低的化学合成方法相比，绿色高效的生物合成方法成为新的研究热点。目前，生物合成D-阿洛酮糖最重要的方法是利用D-阿洛酮糖3-差向异构酶（D-3-，）催化D-果糖在C-3位点发生可逆差向异构化。由结构反应获得。近年来，已有超过20种不同微生物来源的物种在真核和原核表达系统中成功异源表达的报道[8]。转化率一般在20%~35%之间，具有良好的应用前景。

对于纯度要求较高的食品和药品，后期的分离纯化效率对其工业化生产具有重要意义。 D-阿洛酮糖的工业化生产和制备面临着酶催化后残留的底物中D-阿洛酮糖的分离问题，这大大增加了D-阿洛酮糖的生产成本。模拟移动床技术（bed，SMB）是一种可大规模生产的连续色谱分离技术。它可以从混合糖液中分离生物合成得到的D-阿洛酮糖[9]，但设备昂贵。操作繁琐，尚未广泛应用。色谱分离是基于离子交换原理的成熟过程。成本低、操作方便、分离效果好。也已应用于D-阿洛酮糖的料液分离。由于其高溶解度，D-阿洛酮糖很容易吸收水分并在加热时变成玻璃状[10]。因此，结晶困难，很难通过加热干燥得到最终产品，这严重限制了D-聚硅氧烷的发展。工业生产糖。现有报道大多为乙醇结晶法[11]，但该工艺需要使用大量有机溶剂，存在安全隐患、产品收率低、易引入外来杂质、结晶困难、工艺不稳定等问题。成本过高。因此，乙醇结晶法不适合工业化生产。冷却结晶法操作简单，设备要求低。但报道的冷却工艺仍存在结晶周期长、晶粒不稳定、回收率低等缺点。需要进一步优化建立高回收率、节能的方法。低成本结晶方法。

与D-阿洛酮糖的生物转化和合成的上游行业研究相比，目前D-阿洛酮糖的分离、纯化和结晶的下游研究较少。为了进一步提高D-阿洛酮糖的生产效率，必须研究降低D-阿洛酮糖的工业化生产成本，简化下游的分离、纯化、结晶、干燥等工艺步骤。因此，本研究在大肠杆菌中异源表达不同微生物来源的酮糖3-差异异构酶，利用重组工程大肠杆菌获得D-阿洛酮糖料液，并尝试优化D-阿洛酮糖冷却结晶工艺，完成小试阶段D-阿洛酮糖从生物合成到分离纯化再到冷却结晶的全过程，为稀有酮糖的工业化生产提供了重要基础。

1 材料与方法 1.1 实验材料

1.1.1 菌株和质粒

本实验合成了三种不同的D-阿洛酮糖3-差向异构酶靶基因片段，微生物来源为根癌农杆菌( )、Dorea sp.。芽孢杆菌 (ATCC 35704)，分别命名为 DAE01、DAE02 和 DAE03。重组大肠杆菌BL21(DE3,-DAE01)、BL21(DE3,-DAE02)和BL21(DE3,-DAE03)是本实验室构建的。完成引物合成、质粒构建和核酸测序。宿主菌株E. coli BL21(DE3)和质粒(+)由本实验室保存。

1.1.2 基础培养基及主要试剂

LB（Luria-）培养基（g/L）：蛋白胨10，氯化钠10，酵母提取物5，121℃灭菌20分钟，用于培养重组菌株。 T4 DNA 连接酶、卡那霉素、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（-β-De、IPTG）；阳离子交换树脂001×7、阴离子交换树脂313、DTF-Ca2+色谱分离树脂，江苏苏青集团；质粒微量提取试剂盒，。 D-阿洛酮糖标准品（色谱纯），；其它试剂均为国产分析纯。

1.1.3 仪器设备

高效液相色谱仪，Sugar-糖柱，美国公司； HL-2B数字恒流泵、DBS-100自动馏分收集器、ZQZY-70B振荡培养箱、H1多功能酶标仪、夹套结晶器、YRE-201D旋转蒸发仪、DZF-6096真空干燥箱。

1.2 实验方法

1.2.1 重组菌株的构建

在美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中筛选了三种不同微生物来源的编码基因序列，其中DAE01全长为870 bp，DAE02全长为870 bp，DAE03全长为870 bp。长度为867bp。通过密码子优化最终由南京金斯瑞公司合成了优化后的3条基因序列。在C端整合6×His标签，并在基因序列5'端和3'端分别引入Nco Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点，将修饰后的序列通过酶切位点整合到pET-28a(+)中。在该载体中，构建了重组质粒-DAE01、-DAE02和-DAE03。将上述3种重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性转化子，插入卡那霉素抗性LB液体培养基中培养过夜，提取质粒。将获得的3-重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，培养过夜，挑取单菌落进行验证。验证成功后，菌液将送往上海生物技术公司进行测序，测序结果正确的重组菌将被保存。获得3株重组菌株：大肠杆菌BL21(DE3，-DAE01)、大肠杆菌BL21(DE3，-DAE02)和大肠杆菌BL21(DE3，-DAE03)。图1是质粒构建示意图。

图1 重组质粒构建

图1 的

1.2.2 诱导表达与验证

选择验证成功的重组菌，接种至卡那霉素终质量浓度为50 μg/mL的LB培养基中，37℃、200 r/min培养8～10小时，接种量为1.0%（体积分数） ) 适量转移至卡那霉素终质量浓度为50 μg/mL的1 L LB培养基中，扩增培养至OD600值为0.6-0.8，诱导表达。诱导表达条件为：IPTG终浓度0.2-0.5mmol/L，20℃，14-16h。在冰浴中停止诱导 10 分钟。管式离心机收集湿细胞后，用Tris-HCl细胞裂解缓冲液洗涤细胞，控制菌液质量浓度在100 mg/mL。进行超声波细胞裂解。细胞裂解条件为：：功率300W，工作1s，停止2s，15min。 12 000 r/min离心15 min，取上清进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（-gel，SDS-PAGE）进行蛋白验证。

1.2.3 全细胞转化反应条件优化

将一定浓度的湿细菌细胞与不同的缓冲系统（醋酸盐缓冲液pH 5.0~6.0、磷酸盐缓冲液pH 7.0~8.0、Tris-HCl缓冲液pH 9.0~10.0）混合，然后将得到的反应混合物在15-65°下反应C以确定三种不同重组细菌全细胞反应的最佳pH和温度。然后向反应混合物中加入终浓度为5 mmol/L的MnSO4、CoCl2、ZnCl2、NiCl2、MgCl2或EDTA，反应10min，然后高温煮沸5min终止反应。单位D-阿洛酮糖的全细胞催化活性定义为在全细胞反应条件下，单位时间（1分钟）内产生1μmol D-阿洛酮糖所需的全细胞量。最高活性值被确定为相对最大活力（100%）。在上述研究的基础上，3株重组菌（湿菌体质量浓度20-120 mg/mL）在不同的D-果糖质量浓度（50-750 g/L）下合成了D-阿洛酮糖。 ，在最佳反应体系下反应5 h，考察湿菌细胞浓度和底物浓度对全细胞反应的影响。

1.2.4 D-阿洛酮糖的色谱分离

全细胞转化得到的反应液通过阴、阳离子大孔树脂吸附分离盐离子，脱盐脱色后得到的混合液用DTF-Ca2+分离树脂分离纯化。参考邢庆超等人的方法。 [12]，具体参数为：DTF-Ca2+分离树脂经过处理再生后装入26 cm×100 cm夹套层析柱中，装填体积为400 mL。柱平衡后，将脱盐的D-果糖和D-阿洛酮糖混合溶液缓慢滴加到树脂表面，单次进样体积为10 mL。洗脱条件为：去离子水为流动相，柱温60℃，流速1mL/min，使用自动收集器收集洗脱样品，进行HPLC检测，并与D-阿洛酮糖和D-阿洛酮糖进行比较。果糖标准样品。 ，定性和定量量化每个管样品中 D-果糖和 D-阿洛酮糖的浓度。

1.2.5 D-阿洛酮糖冷却结晶工艺优化

采用冷却结晶法对D-阿洛酮糖料液进行结晶，采用HPLC检测结晶率和纯度，确定最佳结晶条件。基本方法是：分离纯化后的阿洛酮糖料液在60℃下旋转蒸发，浓缩至一定质量浓度的料液（1.1、1.2、1.3、1.4、1.5 g/mL），然后加入到系统。筛分质量分数为2.0%的D-阿洛酮糖晶种，然后冷却至终温（5、10、15、20、25℃），在终温停留时间不超过2h，搅拌速率分别为 20、40、80、120 和 150 r/min。晶体结晶后，8 000 r/min离心，4 ℃无水乙醇洗涤滤饼2～3次，50 ℃真空干燥至恒重。对料液浓度、终点温度、冷却速率、搅拌速率等因素进行工艺优化。

1.2.6 HPLC定量分析

HPLC检测条件[13]：600高效液相色谱仪、糖柱、2410差示遮光检测器。流动相为超纯水，柱温85℃，流速0.4mL/min，进样量10μL。 D-阿洛酮糖标准样品的质量浓度为5 mg/mL。所有样品均需用0.22μm微孔滤膜过滤。 D-阿洛酮糖转化率的计算如式(1)和式(2)所示：

(1)

(2)

式中：R1，D-阿洛酮糖生物转化率，％； R2，D-阿洛酮糖结晶率，%； CA、D-阿洛酮糖溶液质量浓度，g/mL； CF、D——果糖溶液的质量浓度，g/mL； mA，结晶后D-阿洛酮糖的干重，g； VA，D-阿洛酮糖进料液的体积，mL。

2 结果与分析 2.1 SDS-PAGE结果分析

从图2中的SDS-PAGE结果可以看出，3个诱导重组大肠杆菌菌株的裂解液上清液均在25-35 kDa处有清晰可见的条带，与目的蛋白的分子量一致，表明证明三酮糖3-差向异构酶可以在大肠杆菌BL21（DE3）中正确表达并且是可溶的。目的蛋白的表达水平也很高。所得粗酶液可用于后续实验。

图2 重组大肠杆菌细胞破裂上清液SDS-PAGE图

图2 SDS-PAGE

大肠杆菌 BL21(DE3) 无细胞

M-蛋白；1诱导的大肠杆菌BL21(DE3，-DAE01)

细胞溶解上清液； 2诱导大肠杆菌BL21(DE3,-DAE02)

细胞溶解上清液； 3诱导大肠杆菌BL21(DE3,-DAE03)

细胞裂解上清（三个目标蛋白的分子量均约为32 kDa）

2.2 重组大肠杆菌转化能力分析及优化

全细胞反应可以在一定程度上减少反应环境对游离酶的影响。在复杂的系统中，整个细胞比游离酶更稳定。同时，全细胞反应避免了复杂的蛋白酶纯化步骤[14]。根据1.2.3节中描述的方法，将三个成功构建的重组大肠杆菌菌株用于D-阿洛酮糖的全细胞生物转化。为了研究温度对重组酮糖异构酶催化活性的影响，在不同温度（15-65℃）下进行全细胞反应。结果如图3-a所示。在一定范围内，随着反应温度的升高，三种不同重组全细胞的催化活性逐渐增强。这是因为当反应温度升高时，可逆反应的平衡向生成D-阿洛酮糖的方向移动。 ，目标产物的收率越高，因此较高的反应温度有利于提高D-阿洛酮糖的生物转化率。 DAE01和DAE03在45-55℃下具有较高的催化活性，均能保持在80%以上。当温度高于55℃时，重组菌DAE01和DAE03的活性急剧下降，相对催化活性低于60%。原因是温度过高，导致酮糖异构酶的酶活性降低，使得重组大肠杆菌的催化活性迅速降低。在全细胞催化转化过程中，反应温度会通过影响酮糖异构酶的催化活性而显着影响静息细胞的催化活性。因此，DAE01和DAE03重组菌的最适反应温度为45-55℃，而DAE02的最适反应温度为65℃，是三种不同重组菌中耐热性最好的。

a-反应温度;b-pH;c-底物质量浓度;d-湿细菌细胞质量浓度

图3 不同因素对全细胞生物转化能力的影响

全细胞图3

为了研究pH对三种重组菌株全细胞催化活性的影响，在不同pH条件的缓冲系统中进行全细胞反应，并按照1.2.3节所述测量相对催化活性。从图3-b可以看出，反应环境的pH值会影响酶蛋白的构象，同时影响活性中心残基和底物分子的解离状态，从而影响酶的催化活性。整个细胞。与大多数其他酮糖异构酶一样，DAE01的最适pH为碱性环境（pH 8.0），当pH低于6.0或高于9.0时，它几乎失去催化活性。 DAE03在中性环境下表现出相对最高的催化活性，但当其处于酸性或碱性体系中时，其催化活性显着降低。这与 DAE01 显着不同，而 DAE02 显示出更广泛的 pH 适应性。 ，在弱酸性条件（pH 6.0）下表现出最高的催化活性，在pH 7.0~8.0的反应环境中相对催化活性高于60%。

金属离子也会对全细胞催化反应产生一定的影响。二价金属离子对重组菌相对催化活性的影响结果见表1。DAE01和DAE03为非离子依赖性酶。添加一些金属离子可以提高其催化活性，如Co2+、Mn2+、Mg2+，而其他金属离子会强烈抑制整个细胞的催化活性； DAE02 依赖于 Co2+。型酶[15]，只有添加Co2+才能充分发挥其催化活性。当体系中不添加Co2+或添加其他金属辅助因子时，其催化活性会降低。此外，反应体系中添加EDTA作为金属螯合剂，显着抑制了三种不同重组细胞的催化活性。三种重组菌的相对催化活性均小于10%。由于EDTA螯合了反应体系中的金属离子，DAE02完全失去了催化活性。考虑到添加过多的金属离子不仅会增加生产过程中的生产成本，而且会给下游生产的分离纯化带来困难，因此DAE03在这方面表现出了良好的生产潜力。

表1 金属离子对重组菌催化活性的影响

表1 金属离子

金属离子 (5 mmol/L)DAE01 相对活度/%DAE02 相对活度/%DAE03 相对活度/%对照 26±1.849±4.3344±4.67Mn2+84±4.3481±3.9684±4.23Co2+100±6.12100±5.29100±3.44Zn2 +15±4.1436±4.6540±2.99Ni2+17±5.2930±2.6938±1.99Mg2+39±2.9614±2.1546±2.±3.4208±1.96

根据上述实验结果，将三种重组全细胞在各自的最佳反应温度和pH下添加适当的金属辅助离子，进行后续的转化实验。研究不同底物浓度和湿细菌细胞对D-阿洛酮糖生物转化率的影响。反应5 h后取样，离心稀释，过滤灭菌，用HPLC检测D-阿洛酮糖的产生量并计算转化率。结果如图3-c和图3-d所示。表达三种不同来源的全细胞反应的转化率随着底物浓度和湿细菌浓度的增加而增加。达到反应平衡后，它们不再继续增加。从结果还可以看出，三类全细胞的D-阿洛酮糖生物转化率基本都在20%~32%。其中，表达DAE01的全细胞在pH 8.0和45℃下进行催化反应，D-果糖达到600 g/L，反应达到平衡后产物转化率达到29.34%，D的质量浓度反应溶液中的阿洛酮糖溶液约为176g/L。表达DAE03的重组全细胞在pH 7.0、反应温度45℃、D-果糖质量浓度750 g/L、湿菌体质量浓度100 mg/mL时获得最高转化效果，转化率为32.19%。当表达DAE02的全细胞在pH 6.0、反应温度65℃、湿细胞质量浓度120 mg/mL下反应5小时时，最高转化率达到32.60%。 HPLC结果如图4所示。综合上述分析，综合考虑未来工业化生产潜力等多重因素，DAE02在耐热性、弱酸性、催化活性等方面表现出了较好的生产价值。因此，后续研究将主要集中于表达DAE02的重组全细胞。本课题继续研究D-阿洛酮糖的下游生产工艺。

图4 全细胞反应产物HPLC结果

图4 全细胞HPLC图谱

2.3 D-阿洛酮糖的色谱分离结果

色谱分离技术利用不同物质在固定相和流动相中分配系数的差异来分离混合物。综合上述结果，选择全细胞转化率最高的大肠杆菌BL21（DE3，-DAE02）进行后续实验。重组菌在最佳条件下反应，按照1.2.4所述方法得到反应液。自动采集器采集的样品经脱盐、脱色、色谱分离后，进行HPLC检测，并分别与标准品进行比较。图5显示了每管洗脱样品中D-阿洛酮糖和D-果糖的定量检测。浓度结果。从图5可以看出，实验成功去除了反应体系中的盐离子，达到了分离D-果糖和D-阿洛酮糖这两种性质相似的组分的目的。分离效果好，可以获得纯度。它的含量为 98.10% D-阿洛酮糖。

a-每管中两种不同成分 D-果糖和 D-阿洛酮糖的浓度；分离样品的 b-HPLC 结果

图5 色谱分离结果

图5

2.4 D-阿洛酮糖冷却结晶工艺优化结果分析

据现有报道，目前D-阿洛酮糖结晶收率最高的工艺是采用乙醇体系进行结晶，通过优化乙醇用量来提高结晶率。但该方法需要添加大量的有机试剂，且不分析结晶过程。目前使用纯水系统重结晶D-阿洛酮糖的方法包括减压蒸发和线性冷却结晶方法[16]。这些方法的突出缺点是能耗高、结晶周期长，收率一般不高于50%。因此，本研究在现有冷却结晶工艺的基础上，采用纯水系统对D-阿洛酮糖进行结晶，进一步优化关键因素，提高结晶效率。

分别设置质量浓度为1.0、1.1、1.2、1.3、1.4和1.5 g/mL的D-阿洛酮糖料液，研究料液对结晶速率的影响。结果如图6-a所示。随着 D-阿洛酮糖溶液浓度的增加，结晶速率也增加。当料液质量浓度低于1.2 g/mL时，D-阿洛酮糖基本无法结晶析出，这与郭元衡等人的研究结果一致。 [11]。表明D-阿洛酮糖冷却结晶过程中，析出晶体的总重量受到料液浓度的影响。进料液的浓度越大，沉淀的D-阿洛酮糖晶体的质量越大。因为在一定温度下，料液浓度越高，溶液的过饱和度越高，导致可以沉淀出更多的D-阿洛酮糖。但考虑到实际生产，如果进一步提高D-阿洛酮糖溶液的浓度，能耗将急剧上升，旋转蒸发浓缩所需的时间也会大幅增加。另外，浓度太高时，浓缩料液输送比较困难，物料损失较大，不利于工业化生产。因此，料液的最佳质量浓度应为1.4～1.5 g/mL。

a-不同料液质量浓度下的结晶回收率； b-不同终点温度下的结晶回收率； c-不同冷却速率下的结晶回收率； d-不同搅拌速率下的晶体纯度

图6 不同因素对D-阿洛酮糖冷却结晶的影响

D-上图6

结晶结束温度对D-阿洛酮糖的结晶过程也有显着影响。不同最终温度下D-阿洛酮糖结晶速率的计算结果如图6-b所示。在5～20℃范围内，随着终点温度的升高，结晶速率也显着增大。当终温低于25℃时，结晶速率迅速下降。最适宜的结晶终止温度应选择在20～25℃范围内。原因可能是系统中加入D-阿洛酮糖晶种后，随着晶体的长大，料液的浓度逐渐降低；此时，温度下降会导致料液过饱和度增加，其大于晶体生长。溶液绝对过饱和度的增加引起的过饱和度的降低使体系处于不稳定区，从而引发二次成核。当然，终点温度的提高可以降低料液的粘度，增加溶质分子的扩散速率，从而提高晶体的生长速率，从而显着减小介稳区的宽度，促进成核[17] ]。当终温过高时，料液溶解度进一步增大，抑制晶核长大，不利于晶体析出。

图6-c显示了冷却速率对结晶的影响。料液冷却速度越大，最终结晶收率越低。这是因为冷却速率越大，料液的最终过饱和度就越大，整个结晶周期就越短。然而，晶体生长速率保持恒定，因此冷却速率越快，D-阿洛酮糖就越有效。结晶时间越短，结晶的材料就越少。另一方面，如果冷却速率太低、结晶周期太长，则会增加结晶过程的能源成本。因此，综合考虑结晶速率和结晶周期时间成本两个因素，最佳降温速率为2～2.5℃/h。

搅拌速度也是结晶过程的重要因素之一。采用 HPLC 测定不同搅拌速度下 D-阿洛酮糖晶体的纯度。测试结果如图6-d所示。结晶过程中搅拌速度越高，最终晶体的纯度越高。越低，当转速为20 r/min时，产品纯度最高，达到98.70%。搅拌速率越高，结晶的驱动力过大，体系中易形成大量微晶，难以附着于晶核，直接以微晶形式存在于溶液中。因此，晶体太小，无法在离心过程中从粘液中去除。分离还容易吸附杂质离子，导致产品纯度降低。

采用优化的冷却结晶工艺对D-阿洛酮糖进行结晶，结晶率达到77.43%，得到D-阿洛酮糖结晶产品。生物法转化的D-阿洛酮糖和D-果糖的混合液经脱盐、脱色、层析纯化、浓缩后，通过优化的冷却结晶工艺得到的D-阿洛酮糖结晶产物不粘连。现象和晶体粒度比较均匀，整个过程不发生美拉德反应，结晶产品不发生褐变，因此产品质量较好。

3 结论与展望

本研究成功构建了-DAE01、-DAE02和-DAE03重组质粒，并在大肠杆菌BL21（DE3）中实现了异源表达。进一步探索不同的全细胞反应条件，比较发现DAE02来源于Dorea sp。相对催化活性较高，最高转化率达到32.60%。同时对D-阿洛酮糖的下游生产工艺进行了探索和开发，得出D-阿洛酮糖的最佳结晶工艺条件为：D-阿洛酮糖料液质量浓度为1.4~1.5 g/mL，结晶结束温度范围为20-25℃，降温速率为2-2.5℃/h，搅拌速率为20r/min。在此最佳条件下进行冷却结晶，最高结晶率为77.43%。该工艺简单易行，不需要添加有机溶剂，可行性较高。在随后的研究中，仍然有必要对D-的结晶动力学进行深入研究，获得更准确的晶体参数和结晶动力学方程，并探索为工业化D-结晶过程的更稳定的理论基础。 ，降低生产成本。

参考

[1] a，f，t等人糖d-：角色和和2型[J]。 ＆，2015，155：49-59。

[2] Han Y，Kwon EY，Yu MK等。成人脂肪质量剂量的研究：A，-blind， - 试验[J]。，2018，10（2）：160。

[3] Lee D，Han Y，Kwon EY等。 D-在C57BL/KSJ-DB/DB小鼠[J]。，2020,25（16）：3656。

[4] M，Hira T，M等。 GLP-1但不是GIP的是D [J]。和，2018，496（3）：898-903。

[5] Y，N，A，A等人，D-，d-和d-，大鼠脂质[J]。食物和2018年，第98（5）：2020- 2026年。

[6] ates，例如，eb，oztop M H. d-和soy在凝胶中的作用[J]。 of，2021，138（8）：49885。

[7] Ogawa M，Inoue M，S等。来自鱼的热量稀有糖d- [J]。食物和2017年，第97、5014-5020页。

[8] Xia Y，Cheng QQ，Mu WM等。 d-：一个和[J]。食物，2021，10（9）：2186。

[9] Liu Yujie。通过模拟移动床色谱法分离D-二糖糖，和D- [D]。 Jinan：山东大学，2020年。

liu y J. of d-和d-使用床[D]。 Jinan：，2020年。

[10] Wang Qi，Peng Chao，Zhou 等。新甜味剂质量果糖的绿色生物制造过程的研究进展[J]。生化工程，2022，8（3）：170-176。

Wang Q，Peng C，Zhou WQ等。在新D- [J]的绿色生物上。 ，2022，8（3）：170-176。

[11]郭元正，卢Zhe，丁等。乙醇系统中D-的结晶过程的优化[J]。食品工业科学技术，2019年，第40（24）：185-189； 198。

Guo YH，Lyu Z，Ding ZY等。 D-在[J]中。和食物，2019年，第40（24）：185-189； 198。

[12] Xing ，Mu ，Jiang Bo等。 D-的分离和纯化[J]。食品工业科学技术，2011，32（9）：236-238; 242。

Xing QC，Mu WM，Jiang B等。和D- [J]。和食物，2011，32（9）：236-238; 242。

[13] Zhang ，Mu ，Jiang Bo等。筛选生物转化D- [J]。食品与发酵行业，2008，34（9）：40-43。

Zhang LT，Mu WM，Jiang B等。 d- [J] .Food and，2008，34（9）：40-43

[14] Park CS，Kim T，Hong SH等。 d-来自D-由细胞的细胞d- 3- [J]。 Plos One，2016，11（7）:。

[15]张WL，Li H，Zhang T等。 Dorea sp的d-3- pH和高[J]。 B：，2015，120：68-74。