海洋全细胞生物催化剂研究进展：从传统到创新的探索

海洋全细胞生物催化剂研究进展：从传统到创新的探索

文本

海洋全细胞生物催化剂研究进展

冯超1,2,孙德群1,2*

（1. 山东大学（威海）海洋学院，山东威海；2. 西南科技大学生命科学与工程学院，四川绵阳）

[摘要]生物催化剂具有较高的化学、区域、异构体和对映体选择性，在获得手性产物方面有很大优势。传统的生物催化剂多为陆地微生物来源的酶或细胞。生活在高盐度、高压的生长环境中，对高盐、有机溶剂、高压等极端条件有很强的耐受性，比陆地微生物更适合作为生物催化剂。越来越多的海洋生物催化剂被成功开发。近年来海洋生物催化剂的研究进展。

[关键词] 全细胞生物催化剂；海洋微生物；手性合成；有机反应

不同构型的对映体在体内可能发挥不同的药理作用：一种可能具有药理活性，而另一种则可能引起严重的副作用。20世纪60年代的“沙利度胺”事件引发了人们对药物的兴趣。对手性的密切关注也直接推动了世界药物管理制度的完善。生物催化剂具有较高的化学、区域和对映体特异性，在手性化合物的合成和外消旋体的拆分中具有很大的优势，生物催化剂在手性合成反应中的应用越来越广泛。但由于酶对有机试剂和高浓度底物的耐受性较低，稳定性较差，大大限制了酶在有机合成中的应用，常采用全细胞代替酶作为生物催化剂。

海洋微生物由于其独特的生存环境，比陆地微生物更适合作为生物催化剂：1）海洋微生物可以在海水中培养，不需要消耗大量的淡水，从而节约了水资源。2）海洋微生物天然生长环境恶劣，对高盐、有机溶剂、低温、高压等极端条件有很强的耐受性和稳定性。3）海洋微生物基数庞大，在特定条件下生长、能催化特殊反应的微生物种类很多，这为新生物催化剂的发现提供了无限的可能性。4）利用全细胞催化反应，不需要加入辅助因子，如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）、黄素蛋白等，细胞内的代谢酶系统可以完成辅助因子的供给和循环利用。 5）采用全细胞催化，省去了酶分离纯化和中间产物分离等步骤，节省了大量的人力和物力。随着航海、深海探测、基因测序等相关技术的不断发展，越来越多的新型海洋生物催化剂被开发出来。本文综述了近年来海洋生物催化剂的研究进展。

1 水解反应

1.1 苯乙腈水解生成2-羟基苯乙酸

在液体培养基中含有适量的葡萄糖和盐的情况下，研究发现8株海洋真菌，包括曲霉菌Ce15、Ce19、DR(M3)2和Gc12菌株，青霉菌和红霉菌Ce5菌株，均对该真菌有活性。苯乙腈可转化为2-羟基苯乙酸（见图1）。2-羟基苯乙酸是合成一些抗高血压药物等生物活性物质的重要中间体。在胞内腈水解酶和腈水合酶的作用下，苄基腈首先水解成苯乙酸，然后在邻位发生羟基化，生成2-羟基苯乙酸。反应转化率可达100%，最终产率为51%。 若对位有氟取代，则羟基的化学反应无法进行，最后只能生成取代的苯乙酸。

1.2 芳基乙腈水解生成芳基乙酸

在聚十二烯曲霉CBMAI 934菌株细胞内的腈水解酶作用下，芳香族脂肪腈（1～3）可水解生成羧酸（见图2）：苯环上的对位、间位、邻位发生甲基取代时，所得产物（4～6）的最终收率分别为76%、52%、46%；当苯环上无取代基时，邻位仍会继续羟基化生成2-羟基苯乙酸；选择合适的固定相固定菌株以及添加合适的诱导剂可提高反应的收率。该菌对一大类底物均有一定的活性，因此有望用于处理含氰废水。

1.3 苄基环氧乙醚的水解

利用海洋曲霉Gc12菌株和木霉Gc1菌株中的水解酶催化苄基环氧乙醚的水解反应，催化产物为两种二醇的混合物（见图3）：多形曲霉倾向于利用S构型底物生成S构型产物，反应后底物-产物混合物中剩余的R构型底物的对映体过量百分比（ee%）为24%～26%，生成的S构型产物的ee%＜10%；木霉Gc1菌株可以利用R构型底物从环氧基β位生成R构型产物，产物混合物中S构型底物的ee%＞60%，R构型产物的ee%可达32%，产率可达25%。

2. β-羟基环酮的酯化

利用芽孢杆菌属BT05和BT03菌株、沙雷氏菌属BOC07和BOC45菌株以及假单胞菌属BT08、BOC06和BOC09菌株催化β-羟基环酮的酯化反应（见图4）：羟基环酮消旋体中只有R构型能在微生物体内脂肪酶的作用下发生酯化反应生成酯。反应完成后，通过色谱柱可将反应体系中的S构型醇分离，再通过进一步水解得到R构型醇，从而将R构型酯与R构型酯分离，从而将两种构型的醇分离开来。醇是合成前列腺素的重要前体，此反应具有很好的工业应用价值。

3 还原反应

3.1 α-叠氮酮的还原

α-叠氮酮可被海洋真菌中的还原酶还原为手性醇（见图5）：当R基团为甲氧基时，核盘曲霉（ （rum））CBMAI 849菌株、芽孢杆菌（ （）CBMAI 857菌株和（）CBMAI 1186菌株将底物转化为R构型醇（ee%＞99%，产率＞91%）。 当R基团为氢时，菌株849催化的主要产物为S构型（ee%=85%，产率=90%），菌株CBMAI 931催化的主要产物为R构型（ee%=90%，产率=91%），白僵菌（ ）CBMAI 738菌株催化的主要产物为R-醇（ee%=80%，产率=91%）；R基团为溴时，青霉菌株CBMAI 931手性选择性较高，催化得到的主要产物为S构型醇（ee%=70%，产率=30%）；当加入硝基时，菌株草酸青霉菌（ ）CBMAI 1185手性选择性较高，主要产物为S构型醇（ee%=51%，产率=42%）。因此，海洋真菌是α-叠氮酮还原的优良催化剂。

3.2 芳香不饱和丙二腈双键的还原

反应得到的芳香族丙二腈化合物在海洋 CBMAI 1186菌株中的烯还原酶催化下发生还原反应，双键还原为单键(见图6a)：R基团为苯基时，采用对位卤代苯基或杂环(如吡啶、噻吩)时，反应产率可达90%以上；当对位芳基被羟基取代时，反应产率较低，当对位芳基被甲氧基取代时，产率为90%；当芳香族基团在对位被硝基取代时，在真菌中的酮还原酶和硝基还原酶作用下，主要产物为醇，硝基被还原为氨基(见图6b)；当R基团为呋喃时，氰基经双键还原后进一步反应生成酰胺。 反应开始的24 h内，双键还原为主要反应，随着反应时间的增加，还原反应速率降低，而氰基水解反应速率增大（见图6c）。

3.3 1-(4-甲氧基苯基)乙酮的还原

1-(4-甲氧基苯基)乙酮在海洋真菌还原酶的作用下可被还原为手性醇(见图7)：海洋真菌 Ce5菌株和 Ce15菌株催化的产物和 菌株催化的产物也为R-醇(7，ee%=69%)，但反应速度较慢，反应不完全；核盘曲霉和白僵菌CBMAI 738菌株催化的产物为S-构型醇(8，ee%＞99%)，底物能够完全反应； (）菌株Gc5催化的产物也为S-构型醇(8，ee%=91%)，但反应速度较慢，反应不完全。 该反应的手性选择性和产率均能取得良好的效果，利用该反应可以得到相应的手性醇。

3.4 真菌催化查尔酮还原

海洋真菌 CBMAI 1186中的酮还原酶可以选择性还原查尔酮中的双键（见图8），而不影响结构中的羰基，反应产率可达70%以上。当R3基团为硝基时，会被真菌中的硝基还原酶还原为氨基。当菌丝体固定在天然生物聚合物（棉花、蚕丝、木棉）上时，菌丝体的反应活性不会受到明显影响。但在4℃下储存一个月后，固定在有机聚合物上的菌丝体仍然具有一定的反应活性，而未固定的菌丝体的反应活性几乎丧失。

3.5 双相体系中不饱和酮的选择性加氢

在磷酸盐缓冲液与正己烷（9:1）的双相体系中，来自海洋真菌 CBMAI 1186菌株的酮还原酶可以催化芳香族不饱和酮中双键的还原（见图9a）。当羰基两侧都有双键时，两侧的双键都会被还原，如果反应时间足够长，产物酮的羰基会进一步被还原生成醇，而且随着时间的推移，R构型的醇发生还原。反应在双相体系中进行，产物和底物均溶解在有机相中，有助于促进反应向产物生成侧进行，反应产率很高，工业应用前景理想。

3.6 芳基酮的手性选择性还原

利用海洋真菌 (ndii)UBOCC-A-菌株、 ( )UBOCC-A-菌株、UBOCC-A-菌株产生的还原酶可以催化芳香酮的还原（见图10a），当选择合适的菌株进行反应时，手性选择性和产率都可以达到很好的水平（ee%＞98%，产率＞90%）。在海水和淡水的培养条件下进行了催化反应，对比不同条件下菌株的活性差异，根据反应数据可知，在海水和淡水中菌株的活性无明显差异； 当乙腈基团连接到羰基右侧时， 的UBOCC-A-菌株和UBOCC-A-菌株均能催化底物的还原反应（见图10b），且具有良好的手性选择性（ee%＞98%）。

粘性红酵母（ ）的UBOCC-A-和UBOCC-A-菌株均能催化还原反应（见图10c），其中UBOCC-A-菌株对该反应具有较好的手性选择性（两种构型产物的比例分别为92%和8%）。

此外，上述筛选出的3株菌株均能催化N-(4-甲氧基-4,5,6,7-四氢苯并噻唑-2-基)乙酰胺的还原反应（见图10d），产率较好（＞93%），且UBOCC-A-菌株对该反应的手性选择性最好（ee%=64%）。

3.7 固定化海洋真菌催化还原芳基酮

将海洋真菌核盘曲霉CBMAI 849菌株和柑橘青霉CBMAI 1186菌株固定化在硅胶、凝胶和壳聚糖上，其还原酶均可催化芳香酮的还原反应（见图11），探究不同固定化底物对细胞催化反应的影响。未固定化的柑橘青霉CBMAI 1186菌株催化化合物9还原时，主要产物为R构型醇（ee%=69%）。当多糖被固定在硅胶上后，主要产物变为S构型醇（ee%＞99%），转化率由40%提高到100%，菌株的催化活性与未固定化菌株一致，产物为S构型醇（ee%＞99%）。

未固定的 CBMAI 1186菌株催化化合物10的反应时，主要产物为R构型醇（ee%=31%），当菌株固定在硅胶上时，主要产物变为S构型醇（ee%=20%），当菌株固定在硅胶上时（ee%=15%），主要产物变为S构型醇（ee%=20%），当菌株固定在硅胶上时（ee%=68%），核盘曲霉CBMAI 849菌株对化合物10的催化活性与未固定化菌株（ee%=65%）差异不明显。两株菌株固定在凝胶上后不再有反应活性，可能是因为凝胶将细胞包裹得太紧，阻碍了底物与细胞的接触，因此，不同的细胞固定底物可能会影响反应的手性选择性和产率，选择合适的固定底物可以促使反应向期望的方向发展。

3.8 α-氯苯乙酮的还原

选定7株海洋真菌，包括微小角青霉Gc5、木霉Gc1、多形曲霉Gc12、Ce19、Ce15、红皮青霉Ce5、以及雷氏青霉Ce16，其胞内还原酶能催化α-氯苯乙酮的还原反应（见图12），主要产物为S构型醇：木霉Gc1菌株手性选择性最好（ee%=66%），但反应速率较低（30%）；酿酒红霉和微小角青霉Ce5和Ce16菌株反应速率均高达99%，但其手性选择性较差（ee%分别为22%和17%），而雷氏青霉Ce16菌株反应速率最高可达95%左右。 研究认为，筛选出的真菌仅在海水培养基中才具有催化活性，在培养基中氯离子浓度较高、且无葡萄糖的情况下，仍能取得更好的催化活性。

3.9 碘苯乙酮的生物转化

所用海洋真菌有9株：核盘曲霉CBMAI 849、多形曲霉Ce19、球孢白僵菌CBMAI 738、总状毛霉CBMAI 847、柑橘青霉CBMAI 1186、小青霉CBMAI 1187。霉菌菌株Ce16和Gc5、草酸青霉CBMAI 1185、木霉Gc1中的还原酶均能催化碘代苯乙酮的还原反应（见图13），当碘位于邻位时，柑橘青霉CBMAI 1186的催化效果最好（ee%＞99%，转化率＞80%），主要产物为S构型醇； 当碘位于间位时，核盘曲霉CBMAI 849菌株催化的反应手性选择性最好（ee%＞99%），主要产物为S构型醇；米氏青霉Ce16菌株催化的反应转化率最高（56%），主要产物为S构型醇；当碘位于对位时，曲霉Ce19菌株催化效果最好（ee%＞99%，转化率＞92%），主要产物为S构型醇，而白僵菌 菌株的主要产物为R-构型醇（ee%＞99%，转化率＞70%）。

此外，青霉菌CBMAI 1185细胞中还存在一种酶，可以催化还原反应的逆反应，将产物醇氧化成酮（见图14）。该菌株对S构型醇的利用能力较好，可以快速氧化，而R构型的反应较慢。

3.10 α-酮酯和α-酮酰胺的手性还原

嗜盐菌属中的还原酶能催化α-酮酯的手性还原反应（见图15），催化下反应转化率较高（>99%），当R基团为甲基或乙基时，反应手性选择性良好（ee%＞96%，ee%＞99%）。向反应体系中添加L-谷氨酸等添加剂，不会明显影响反应的手性选择性；催化效果不如嗜盐菌。另外，嗜盐菌也能催化α-酮酰胺的还原（见图16），当反应时间足够长时，可以达到比较理想的催化效果（转化率>99%，两株菌催化下的ee%分别为92%和99%）。

4 具有氧化还原活性的生物催化剂

sp.在厌氧条件下（反应体系中充满氮气）表现出酮还原活性（见图17），主要产物为S构型醇（ee%＞99%），转化率为58%；在有氧条件下（反应体系中充满氧气），主要活性为醇氧化（见图18），S构型醇被氧化为酮，而R构型被保留，最后反应体系剩余的部分主要为R构型醇（ee%＞96%）；当苯环上的取代基为杂原子基团如三甲基硅基、亚磷酸二乙酯、三丁基锡或频哪醇硼酸酯时，仍可获得良好的催化效果。

5 香紫苏醇和香紫苏内酯的羟基化

在海洋真菌 sp. CBMAI 1195菌株催化下，香紫苏醇的3碳位和18碳位均可发生羟基化反应（见图19），所得产物（11～12）的产率分别为31%和10%；海洋真菌 CBMAI 934菌株、 (sp.)和 spp.(sp.)均能催化的羟基化反应（见图20）。 CBMAI 934菌株催化产物为1碳位羟基化产物（13），产率为14%。 和 spp.催化产物为3碳位羟基化产物（14），产率分别为11%和17%。

和 CBMAI 1197菌株均能催化克拉利德尼的羟基化反应（见图21），反应产物均为3碳位置的羟基化产物，产率分别为7%和34%；该反应具有一定的区域选择性，选择不同的菌株可实现不同反应位点的羟基化，反应产物均为单羟基化产物，但反应时间较长，产率较低。

6 结论与展望

除了以上介绍的反应外，海洋微生物还有许多不同的用途，如获取生物燃料、处理农药残留、通过生物发酵获取核苷酸及其类似物、活化Pd催化剂、利用微生物氧化还原反应制作生物电池等。每一种技术都有其优缺点，海洋全细胞生物催化剂也不例外：1）在实验室条件下，大多数海洋微生物无法进行人工培养，不能直接应用于科研和生产；2）细胞需要稳定的条件才能正常生长和代谢，反应体系的变化可能会影响催化效率；3）每次反应获得的产物量较少，反应​​效率较低；4）细胞膜的屏障作用会阻碍物质的进出细胞，阻碍酶促反应的正常进行；5）微生物细胞内代谢途径复杂，可能相互干扰或竞争，从而影响反应效率并生成副产物。 以上原因导致全细胞催化反应的不确定性较多，成本较高，限制了其在工业上的推广应用。

针对生物催化剂存在的各类问题，人们进行了大量的研究和尝试。1）利用生物信息学、宏基因组学的方法寻找新的生物催化剂：通过对已知生物催化剂的基因组进行分析，并用计算机比对，从构建的环境微生物大基因文库中筛选出有潜力的基因序列，将选定的基因导入表达载体，对载体细胞进行培养筛选，发现新的生物催化剂。无需培养微生物，就能筛选出不能人工培养的微生物，筛选更有针对性和准确性。2）在双相体系（水相-有机相、水相-非离子溶剂相）中进行生物催化反应，可以降低底物和产物对微生物的毒性；非水相对产物能很好的溶解，促使反应平衡向产物形成的一侧移动；避免有机溶剂对微生物的抑制作用； 产物和底物中的大部分物质溶解在非水相中，降低了后续纯化的难度。3）利用基因工程将原来没有的代谢途径引入细胞中，即将已知的代谢物代谢途径引入细胞中，使之能够催化多步反应或合成以前不能合成的物质。例如海洋菌种有能合成多不饱和脂肪酸的酶，但海洋菌种培养困难、生长缓慢，通过基因工程将编码催化合成多不饱和脂肪酸的酶的基因引入粘球菌中，再以粘球菌为表达载体，催化多不饱和脂肪酸的合成。将脱羧酶和还原酶基因引入大肠杆菌中，可以简化原来的三步反应，让大肠杆菌直接催化最终产物2-苯乙醇的合成。 4)通过基因工程的方法可以抑制竞争途径和产物分解途径，从而提高产物合成效率。例如通过敲除大肠杆菌细胞中利用γ-氨基丁酸（GABA）的酶系统，可以提高GABA的产量。5)用物理或化学的方法处理细胞膜，在细胞膜上产生孔洞，使底物容易进入细胞，而完整的细胞膜保证细胞内部的蛋白质等物质不会流出，这样就增加了底物和细胞内酶的接触机会。6)增加重要中间体的供应或将重要中间体循环所需的酶引入细胞内，可以加速反应并降低反应成本，如将NAD(P)+/NAD(P)H的自循环、三羧酸循环所需的酶系统引入细胞内。

综上所述，海洋生物催化剂在有机合成和手性化合物的获取中的应用前景十分广阔，是人们减少环境污染、提高生产效率的极佳选择。优化反应条件、提高催化效率、提高反应选择性、开发新型催化剂仍是未来科研人员努力的方向。有理由相信，随着微生物技术的发展和人们对海洋的深入探索，将会开发出更多、更优的海洋生物催化剂。

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