酶工程基础：名词解释与酶活力的国际单位规定

酶工程基础：名词解释与酶活力的国际单位规定

第 1 章 酶工程基础

1.名词解释：酶工程、比活性、酶活性、酶活性国际单位、酶反应动力学

①酶工程：是酶学与化学工程技术、基因工程技术、微生物学技术等相结合的新技术。是在工业上有目的地设计一定的反应器和反应条件，利用酶的催化作用，在常温常压下催化化学反应，生产人类所需要的产品或服务于其他用途的应用技术。

②比活力：指特定条件下，单位质量的蛋白质或RNA所具有的酶活力单位数。

③酶活力：又称酶活力，是指酶催化化学反应的能力。其大小可以用一定条件下酶催化化学反应的快慢来表示。酶催化反应的速度越快，酶活力越高。

④酶活力国际单位：1961年国际酶学会议规定：在特定条件下（25℃，其他最适条件），每分钟转化1μmol底物或催化生成1μmol产物所需的酶量为1个酶活力单位，即国际单位（IU）。

⑤酶反应动力学：指主要研究酶反应速率规律以及各种因素对酶反应速率影响的科学。

2. 酶研究简史

酶研究的简要历史如下：

（1）用途不明：酿酒、酱料制作、糖果制作、医疗等。

（2）酶学的出现：1777年意大利物理学家开山鹰实验；1822年美国外科医生研究食物在胃内的消化情况；19世纪30年代德国科学家施旺获得胃蛋白酶。

1684年，比利时医生提出酶——在酿酒过程中引起物质变化的因子（酶）；1833年，法国化学家Payen用酒精处理麦芽提取物，得到淀粉酶；1878年，德国科学家Kűhne提出从生物体中分离出来的酶，意思是“在酵母中”（希腊语）。

（3）酶学（理论研究）迅速发展：1926年，美国康奈尔大学独臂学者萨姆纳博士从刀豆中提取出尿素酶晶体，证明其具有蛋白质的性质；1930年，美国生物化学家分离出胃蛋白酶、胰蛋白酶和凝乳酶晶体，确立了酶的化学本质。

3. 谈谈酶工程的发展

一、酶工程开发如下：

①1894年日本科学家高峰良二利用米曲霉制备淀粉酶，酶技术实现商品化：

②1908年德国罗姆利用动物胰腺生产出胰蛋白酶，用于皮革软化、洗涤；

③1911年从木瓜中分离出木瓜蛋白酶，用于澄清啤酒；

④1949年，利用微生物液体深层培养发酵生产α-淀粉酶，揭开了现代酶工业的序幕；⑤1960年，法国科学家雅各布和莫诺提出的操纵子学说，阐明了酶生物合成的调控机制，通过诱导和解除对酶的阻遏可显著提高酶产量；

⑥1971年，各国科学家开始使用“酶工程”一词。

二、在酶的应用过程中，人们注意到酶的一些缺点，如稳定性差、对强酸强碱敏感、只能一次性使用、分离纯化困难等，解决的办法之一就是固定化。

固定化技术的发展经历了如下过程：

①1916年等发现蔗糖酶吸附在骨炭上仍有催化活性；

②1969年日本千津贺一郎首先利用固定化氨基酰化酶在工业规模上由DL-氨基酸生产L-氨基酸；

③1971年，第一届国际酶工程会议在美国召开，会议的主题是固定化酶。

4.酶的催化特性

酶催化的特点是：

①极高的催化效率：在37℃以下，酶的催化速率是不用催化剂的化学反应速率的1012-1020倍；

②专一性强：一种酶只作用于一种或一类化合物，或某一化学键，催化某一化学反应，生成某一产物；

③活性不稳定：酶的催化反应需要温和的条件。强酸、强碱、高温等条件均可使酶遭到破坏，完全失去活性。因此，酶作用一般要求相对温和的条件，如常温、常压、pH接近中性等。

④活性的可调性：酶的催化活性是受到调控的。酶促反应受多种因素的调控，以适应机体对不断变化的内外环境和生命活动的需要。调控有三方面：a.对酶生成和降解的调控；b.对酶催化效率的调控；c.通过改变底物浓度对酶的调控等。

5. 简述影响酶催化作用的因素

影响酶催化作用的因素有内在因素和外在因素，内在因素包括：酶浓度、底物浓度和产物浓度；

外部因素包括：温度、pH值、活化剂和抑制剂。

①底物浓度：当底物浓度很低时，随着底物浓度的增加，反应速率急剧增加，二者成正比，表现为一级反应；随着底物浓度的增加，反应速率不再成正比增加，反应速率的增幅继续减小；若底物浓度继续增加，反应速率不再增加，表现为零级反应。此时无论底物浓度增加多少，反应速率都不再增加。

②产物浓度：生物代谢过程中产生的中间产物或最终产物，是酶的变构剂，引起酶构象的改变，影响酶的反应速率，是一种反馈调节作用。

③酶浓度：在底物浓度足够高的条件下，酶催化反应的速率与酶浓度成正比。

④温度：在一定的温度范围内，随着温度的升高，反应速率加快。一般温度每升高10℃，反应速率约增加一倍。超过一定范围，温度过高会引起酶的三维结构改变，甚至变性，导致催化活性下降，反应速率随温度升高而减慢。

⑤pH：当酶分子处于最适pH值时，催化反应速率达其最大值；当反应介质的pH偏离酶的最适pH值时，会影响酶与底物的结合，进而影响反应速率，因此必须控制好pH值。

⑥活化剂：凡能增加酶活性的物质称为活化剂，大多数是离子或简单的有机化合物。

⑦抑制剂：凡能降低酶活性，而不引起酶蛋白变性的物质称为酶抑制剂。通常按抑制作用分为可逆抑制和不可逆抑制两类。

6. 解释米氏方程的意义

这个方程就是米氏方程，是在假设存在稳态反应条件的情况下推导出来的。

其中：Km值称为米氏常数，是酶反应速率为最大酶反应速率的一半时的底物浓度；

Vmax是酶被底物饱和时的反应速率；

[S] 是底物浓度。

米氏方程表示酶催化反应的初速度（v）与底物浓度（S）之间的关系，其意义：①该方程反映了反应性质、反应条件与反应速率之间的关系；

②反映反应速率与底物浓度的关系，当[S]远大于Km时，反应速率与底物浓度无关。

③反映酶反应速率与酶浓度的关系，当[S]远大于Km时，v=k2[E0]为线性关系，酶活力与酶浓度成正比。

第2章 酶发酵工程

1. 术语解释：诱导剂、（诱导效应）、终产物抑制、分解代谢物抑制、葡萄糖效应

①诱导物：能诱导酶的初始合成（通常是酶的底物）的物质，能引起阻遏蛋白的构象变化，使其不利于与操纵基因结合，例如乳糖；而由阻遏酶产生的能引起阻遏蛋白构象变化，从而有利于其与操纵基因结合的物质称为辅助阻遏物，例如氨基酸、核苷酸等。

②终产物阻遏：催化特定产物合成的酶，当培养基中存在该产物时，往往不能合成，即受到阻遏。

③分解代谢物抑制：大肠杆菌在含有两种可分解底物（如葡萄糖和乳糖）的培养基中生长时，会先分解利用其中一种底物（葡萄糖），而不分解另一种底物（乳糖）。这是因为葡萄糖的分解代谢物抑制了分解和利用乳糖的相关酶的合成。这种作用称为分解代谢物抑制。

④葡萄糖效应：由于葡萄糖常对分解和利用其他底物的有关酶的合成有抑制作用，因此这种代谢产物的抑制又称为葡萄糖效应。

2.举例说明酶生物合成调控机制对酶发酵工艺优化的指导意义

乳糖是大肠杆菌合成β-半乳糖苷酶的诱导剂，若仅以乳糖为碳源，则发酵单位增大，但成本增加。若采用适当比例的葡萄糖和乳糖组成的混合碳源，可提高产量，同时降低发酵原料成本。利用嗜热芽孢杆菌生产α-淀粉酶时，用甘油代替果糖，解除分解代谢抑制，可使产量提高25倍左右。利用活体枯草芽孢杆菌生产蛋白酶时，若培养基中含有氨基酸，酶产量很低：若除去培养基中的氨基酸，蛋白酶产量将大大提高。再如，枯草芽孢杆菌的鸟苷发酵，是典型的代谢控制发酵，采用的是腺嘌呤营养缺陷型突变体。 在发酵过程中人为地限制腺嘌呤的浓度，使细胞代谢途径中的腺嘌呤核苷酸浓度维持在不引起关键酶的反馈抑制和阻遏的水平，有利于鸟嘌呤核苷酸的积累。

3.举例说明酶生物合成调控机制对产酶生物菌株改造的指导意义

如果通过基因工程和传统的诱变技术，获得在抗代谢物存在下能正常生长的突变菌株，一些突变菌株相关酶系统的合成对这类抗代谢物不敏感，也解除了某些代谢物对相关酶系统的反馈抑制。例如，异亮氨酸合成途径中的关键酶高丝氨酸脱氢酶，就受到蛋氨酸的反馈抑制。通过培育抗蛋氨酸结构类似物的突变菌株或蛋氨酸缺陷菌株，可以增加该酶的量，从而提高异亮氨酸的产量。此外，在育种工作中，也可以筛选组成型菌株来提高酶的产量。 以β-半乳糖苷酶的生产为例，当诱导菌株在含有抑制物质o-硝基-β-D-岩藻糖苷和乳糖的培养基中培养时，诱导酶的合成受到抑制，野生型因不能利用乳糖而无法生长，但组成型酶突变体对乳糖的利用却不受限制，因此在此环境中生长的突变菌株为组成型酶生产者。

4、酶发酵过程中提高酶产量的措施有哪些？

①添加诱导剂：对于诱导酶的发酵生产，在发酵培养基中添加诱导剂，可明显提高酶产量。诱导剂一般分为三类：酶底物，如青霉素是青霉素酰化酶的诱导剂；酶反应产物，如纤维二糖，可诱导纤维素酶的产生；酶底物类似物，如异丙基β-D-硫代半乳糖苷，对β-半乳糖苷酶的诱导作用比乳糖高数百倍。

②降低阻遏物浓度：微生物酶的产生受代谢终产物阻遏和分解产物阻遏的调控。为避免分解产物的阻遏，可使用难以利用的碳源，或分批加入碳源，使培养基中碳源保持在不引起分解产物阻遏的浓度。

③添加表面活性剂：在发酵生产中，常使用非离子表面活性剂作为酶促剂，但其作用机理尚未充分研究。

④添加酶促进剂：酶促进剂是指一些对微生物生长不是必需的，能增加酶产量，但作用机理尚未明确的物质，可能是酶的激活剂，也可能是酶的稳定剂。

5.谈谈微生物酶产生菌株的要求

对于产酶菌来说，一般必须满足下列条件：

①产酶量高；

②易于培养和管理，产酶细胞容易生长繁殖，适应性强，易于管理；

③菌种遗传稳定，不易发生突变和退化，不易受噬菌体的感染，保证生产的稳定性；

④该菌株可使用廉价原料，发酵周期短，生产成本低；

⑤发酵产物有利于酶产物的分离纯化，优选分泌型胞外酶；

⑥该菌种安全可靠，不是致病菌，不会产生毒素或其他有害物质，不影响生产人员的健康；

⑦转基因菌株必须符合安全要求。

6.如何筛选酸性蛋白酶高产菌株？

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 出发菌株：黑曲霉

1.1.2分离与斜面培养基：斜面培养基为PDA培养基、察氏培养基，分离培养基为添加1％酪蛋白的察氏培养基。

（1）PDA 培养基；

（2）察氏培养基：硝酸钠3g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，蔗糖30g，琼脂20g，蒸馏水1L。加热溶解，调至自然pH，分装后121℃灭菌20min。

培养方法：按要求配制发酵基质，调节初始含水量和pH，取150g分装于1L锥形瓶中，0.1MPa压力灭菌30min，冷却后按0.3%接种量接种，在不同条件下发酵84h，干燥后测定酶活。

2 实验方法

2.1菌株的分离纯化:采用常规稀释分离法。

2.2 菌株诱变

取0.1 ml稀释孢子悬浮液涂布于初次筛选平板上，30℃培养4 h，紫外灯预热30 min，然后将平板置于距15W紫外灯30 cm处，分别照射0 s（对照）、4 min、6 min、8 min、10 min、12 min（每组2组）。然后在暗光条件下用5 mL无菌生理盐水洗净平板上的菌液，适当稀释后涂布于分离平板上，用黑布包好，30℃避光培养3~4 d。根据长出的菌落与水解圈直径的比值大小及菌落形态的变化情况，选取所需菌株，编号保存。同时根据平板上的菌落数计算致死率，进而得出存活率。

致死率（%）=（AB）/A×100

式中：A为对照组平板上菌落数；B为诱变处理后平板上菌落数。

2.3 酶活力测定方法

酶活力定义：1g酶粉在40℃、pH3.0的反应条件下，1分钟水解酪蛋白，生成1μg酪氨酸，为一个酶活力单位（U/g）。

3 结果与分析

3.1 菌株选育结果

为了筛选出在固体培养条件下产酶量高的菌株，经紫外诱变后获得了100余株突变菌株。这些菌株在形态上存在一定的差异，根据其菌落形态、菌落大小、孢子颜色及孢子饱满度、水解圈大小等指标，筛选出20株菌株进行三角瓶液体发酵产酶测定，获得10株高产菌株后再进行三角瓶固体发酵培养复选。其中，z-10酶活力最高，为9284U/g(干基)，比出发菌株(CK)提高了11.1倍。紫外诱变的机理是作用于嘧啶，形成嘧啶二聚体(主要是TT)，影响DNA的正常解链和碱基配对，从而引起基因突变，提高酶产量。

7. 结合酶生物合成模型，如何增加酶的合成量

（1）遗传控制

①诱变育种

a. 将诱导型改为组成型：培育组成型突变体

b. 将压抑类型转变为去压抑类型

c. 缓解反馈抑制：培育营养缺乏突变体、培育结构类似物抗性突变体

d. 缓解分解代谢抑制：培育对分解代谢抑制有抵抗力的突变体

②基因工程育种：改变细胞调控基因，使菌株由诱导型转变为组成型；增加结构基因的拷贝数，增加细胞特异性酶的产量。

（2）条件控制

①添加诱导酶的底物、底物前体、反应产物、酶的底物类似物或底物调节剂

②降低抑制剂的浓度：

产物抑制：去除最终产物；添加阻止产物形成的抑制剂

分解代谢抑制：避免使用葡萄糖，避免培养基太丰富，添加一定量的cAMP

③添加表面活性剂：离子型（Tween-80），对细胞有毒性；

非离子（-100），增加细胞通透性。

④添加酶促剂：酶促剂对不同细胞和酶的作用效果不同，需通过试验选择合适的酶促剂并确定最佳浓度。其作用机理尚不明确。如添加钙镁植酸可使桔霉素产生的磷酸二酯酶量增加10～20倍。

第3章 酶分离工程

1.术语解释：ATPE、IEC、HPLC、2-DE。

2. 细胞破碎的方法有哪些？其原理是什么？

细胞破碎按处理方法一般分为机械破碎、物理破碎、化学破碎和酶破碎。

①机械破碎：利用机械运动产生压缩力、剪切力破碎组织细胞，具有处理量大、破碎效率高、速度快等优点。细胞机械破碎方法主要有捣碎、研磨、均质等。

②物理破碎法：此方法利用温度、压力、声波等物理因素破碎细胞，多用于微生物细胞破碎，常用的破碎方法有温差法、压差法、超声波法等。

③化学破碎法：利用各种化学试剂作用于细胞膜来破碎细胞的方法。常用的化学试剂有甲苯、丙醇、丁醇、氯仿等有机溶剂，、Tween等表面活性剂。

④酶促破碎法：根据细胞壁结构特点，选择适当的酶，在低渗透压溶液中破坏细胞壁、使细胞破裂的方法称为酶促破碎法。其中，在一定条件下，利用细胞自身酶系统的催化作用使细胞破碎的方法称为自溶法。自溶法的效果受温度、pH、离子强度等因素的制约。必要时，应加入适量的甲苯、氯仿等防腐剂，以防止自溶体系中其它微生物的生长。

3、酶的提取方法有哪些？影响酶提取的主要因素有哪些？

根据酶提取所用的溶剂或溶液不同，主要的酶提取方法有盐溶液提取、酸溶液提取、碱溶液提取和有机溶剂提取等。

①盐溶液提取法：蛋白质在低浓度盐溶液中的溶解度会随着盐溶液浓度的增加而增大，这种现象称为盐溶解。这是由于蛋白质分子吸附一定的盐离子后，表面带电导致蛋白质分子间相互排斥，而蛋白质分子与水分子间的相互作用加强，从而增加了溶解度。

②酸溶液提取法：有些酶溶解度比较大，在酸性溶液中比较稳定，这类酶要用酸溶液提取，pH一般控制在2-6，应根据酶的性质选择合适的pH，避免pH过低造成酶失活。

③碱溶液提取法：有些酶溶解度较大，在碱溶液中比较稳定，这类酶要用碱溶液提取，pH一般控制在8～12，应根据酶的性质选择合适的pH，避免pH过高造成酶失活。

④有机溶剂提取法：有些酶蛋白与脂质结合较牢或分子中非极性侧链较多，难溶于水、稀盐、稀酸或稀碱，常采用与水混溶的有机溶剂提取，如乙醇、丙酮、丁醇等。

酶主要是蛋白质，影响蛋白质纯化的因素也会影响酶的纯化。酶提取过程中最重要的是防止酶变性失活。影响酶提取最重要的因素是酶在所用溶剂中的溶解度以及酶扩散到溶剂中的难易程度。此外，在提取过程中还应注意以下因素的影响：

1)温度：为防止酶变性、失活，提取温度不宜过高。特别是采用有机溶剂提取时，整个提取操作应尽可能在低温下进行。

2）PH：酶提取液的PH首先要保证蛋白的稳定性，为了增加酶的溶解度，提取时溶液的PH应远离酶的等电点。

3）搅拌：搅拌可促进酶在提取液中的溶解，一般以轻柔搅拌为宜，搅拌太快易产生大量气泡，增加与空气的接触面积，导致酶蛋白变性、失活。

4)污染：酶液是微生物生长的良好培养基，纯化过程中应尽可能防止微生物对酶的破坏。

5）提取液用量：增加提取液用量，可提高提取率。但提取液过多，会使酶浓度降低，不利于进一步分离纯化。因此，提取液用量一般为含酶原料体积的3-5倍，且应少量多次使用，可获得较好的提取效果。

4、差速离心和密度梯度离心分离酶的原理和特点是什么？

差速离心的原理：利用不同的离心速度和离心时间，分批分离不同沉降速度的颗粒的方法称为差速离心。操作时，将均匀的悬浮液离心，选择离心力和离心时间，使大颗粒先沉降。取出上清液，在增加离心力的情况下再次离心，以分离较小的颗粒。反复离心，可分批分离不同大小的颗粒。

特点：差速离心得到的沉淀物含有较多杂质，需要多次重悬、离心才能得到较纯的分离产品。差速离心主要用于分离粒径、密度差别较大的颗粒，操作简便，但分离效果较差。

密度梯度离心原理：密度梯度离心又称速度区带离心。密度梯度离心是指样品在密度梯度介质中进行的一种沉降速度离心。密度梯度体系是在溶剂中加入一定的梯度介质制成的。梯度介质应有足够大的溶解度，形成所需的密度，不与被分离组分发生反应，不使被分离组分凝固、变性或失活。常用的有蔗糖、甘油等。等密度梯度离心又称平衡密度梯度离心。等密度梯度离心虽然也是在密度梯度介质中进行，但被分离物质是利用其密度不同而分离的。这种离心方式常用无机盐制成密度梯度。

特点：不同大小、形状、沉降系数的颗粒经离心后，在密度梯度溶液中形成多个不连续、界面清晰的区带（如左图所示），各区带颗粒相对均匀，分离效果较好。在密度梯度离心过程中，区带的位置和宽度随离心时间的变化而变化，随着离心时间的增加，由于颗粒的扩散，区带会越来越宽。为此，适当增加离心力、缩短离心时间，可以减小区带的加宽。

5、双水相萃取和反胶束萃取的原理是什么？它们在酶的分离纯化中起什么作用？

双相水萃取的原理：选择性分离是基于样品中目标组分在两相之间不同的分配系数。当样品加入到双相水体系中时，由于表面性质、电荷效应、各种力（如疏水键、氢键和离子键等）的存在以及环境条件的影响，两相中组分的浓度不同。由于体系处于平衡状态时，分配系数等于目标组分在两相中的浓度比，因此可以利用组分的不同K值来分离双相水萃取体系中的物质。

应用：两阶段提取已用于将各种生物学酶分开，例如使用PEG/磷酸盐水溶液系统从发酵肉汤中提取碱性二甲烷酶，使用PEG/ 使用PEG/ 提取和纯化葡萄糖酶，使用PEG/水溶液两相系统分离过氧化物酶等。此外，在水溶液的两阶段系统中也很好地分离了α-淀粉酶，胆固醇氧化酶，脂肪酶，纤维酶，L-天冬酰胺酶等。

反向胶束提取的原理：当蛋白质样品与反向胶束溶液的表面和蛋白质的表面相互作用时，含有蛋白质的反向胶束在两个阶段的界面上形成，蛋白高发相条件（例如pH，离子强度等），可以调节蛋白质以回收到水相中，从而获得阳性提取或反向提取过程并恢复靶蛋白。

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6.您如何理解灌注色谱是生物大分子的分离和纯化技术的主要突破？

灌注色谱的建立是近年来色谱技术发展的主要突破。

灌注使用流动相和溶质的对流效应，以减少培养基中溶质保留的限制，并显着缩短蛋白质的分离时间。要以高流量为单位的传质，分离度基本上不受影响，在室温下进行操作，生物活性物质的活性损失很小，恢复速率很高，并且可以同时进行分析和准备。

灌注色谱技术代表了一种解决液相色谱法的先进技术。

7.酶结晶的原理是什么？

酶结晶的原理：通过缓慢改变母液中酶蛋白的溶解度，使酶略微过饱和，然后结合适当的结晶条件，可以获得酶晶体。

有许多因素会影响酶蛋白的结晶，这些因素可以分为物理因素，化学因子和生化因素。

物理因素：实现平衡，温度，重力，压力，电解质特性以及介质，均质或异质成核的粘度等。

化学因素：pH，沉淀物类型和浓度，离子物种和强度，过饱和，氧化/还原环境，酶浓度，交联，存在洗涤剂和杂质等。

生化因素：酶纯度，抑制剂，酶蛋白的聚集状态，酶水解，化学和遗传修饰，对称性，稳定性和蛋白质本身的等电点等。

第4章固定酶和固定的细胞

1.比较使用游离酶，固定酶和固定细胞作为催化剂的优点和缺点。

（1）作为生物催化剂的酶的优势和缺点

优点：高催化效率；

缺点：稳定性不佳；

（2）固定酶的优势和缺点

优势

①将固定的酶与底物和产品分开非常容易；

②可以在很长一段时间内反复使用，这有利于该过程的连续性和管道化。

③可以严格控制酶反应过程，这有利于过程自动化。

④在大多数情况下，它提高了酶的稳定性。

⑤更适合多酶反应。

⑥酶利用率的效率得到了提高，产品产量提高，保证产品质量并且成本较低。

缺点

①固定过程中发生的物理和化学变化会损害酶的活性中心，并可能导致酶活性降低。

②酶连接到固相载体后，酶蛋白的构象和活性中心可能会发生变化，并且载体骨架和侧链可能会导致空间障碍，从而影响底物和酶分子的方法，从而减少烯烃分子的实际催化活性。

③IT仅适用于催化可溶性和较小的分子底物，不适用于大分子底物。

④与完整的细胞相比，它不适合多酶反应，尤其是需要辅助因素的反应。

（3）固定细胞的优势和缺点

固定细胞的优势

与固定的酶相比，固定的细胞具有以下优点：

①固定的细胞保留了细胞中的原始多酶系统，这使它们可以充当单个酶，还使用它们包含的复杂酶系统来完成代谢的一部分，甚至是整个发酵过程，尤其是那些需要参与辅助因素的合成代谢过程

②固定的细胞维持细胞内酶系统的原始状态和自然环境，因此更稳定，因为固定的细胞具有完整的自由细胞系统的优势，并且可以降低酶的成本，并降低了损失，因此可以降低酶的损失，从而降低酶的成本，从而降低了损失。固定细胞的制备和使用比固定的酶更简单，因此固定的细胞已被广泛用于工业生产和科学研究中。

与游离细胞相比，固定生长细胞的优势如下：

①固定的生长细胞可以增殖并增加细胞密度，因此可以获得高度致密和减少基因工程的细菌聚集体，这不需要经过多重培养和对普通发酵的扩增，从而缩短了发酵周期并提高了生产能力。

②它可以提高基因工程细菌的遗传稳定性，使发酵性能更稳定，并且可以长期反复或连续使用，这有利于生产自动化。

③当使用固定的细胞发酵时，发酵液基本上不包含（或几乎包含）细菌，这有利于分离和纯化产品的分离和改善产品质量，因为固定的细胞不仅利用了一些固定的元素，还可以启动频繁的元素，但可以通过启动的启发，启动了 the the the the the the the Uni the usom the in ucom and ucom of 。并且固定细胞的制备比固定酶的细胞更容易，目前认为固定细胞的应用前景可能更好。

固定细胞的局限性

①该技术只能用于产生细胞内酶的细菌。

②细胞中的多种酶会形成不良的副产品，例如，加热，添加酸或表面活性剂，例如，当使用固定的 to for for for to and to and to for to and ，添加了酸性剂量。副反应的问题是使用不同的菌株。

③固定的细胞不仅由于固定化而具有扩散限制，例如载体形成的孔径会影响聚合物底物的渗透性，而且还会增加细胞膜，也会影响细胞膜，

细胞壁扩散限制。

④由于微生物本身的复杂性，形成的固定细胞通常具有低稳定性和酶活性水平。

⑤在使用的初始阶段，某些细胞成分通常会渗出，从而影响产品质量。

⑥如果底物（或产品）是一种高分子量物质或不溶性物质，则使用非常麻烦。

2.简要描述常见的酶固定方法，固定化的基本原理及其各自的优势和缺点。

（1）载体结合方法

它是将酶结合到水不溶的固体载体，根据不同的组合方法，可以将其分为以下方法。

1个物理吸附方法

无机载体，例如高岭土，硅胶，氧化铝，活化碳，羟基磷灰石等

有机载体，例如纤维素，合成树脂，胶原蛋白，淀粉等，具有比无机载体更高的吸附能力。

2离子结合方法

离子结合方法是一种固定方法，其中酶通过适当的pH和离子强度条件下的离子键与水不溶性载体结合。

物理吸附的优点是：这种方法不容易破坏酶的活性，并且酶的高阶结构几乎没有变化，因此酶活性的损失很小，但是，固定的酶相互作用是通过物理吸收和载体较弱的方法。治疗条件，活性中心中的酶和氨基酸残基不容易被破坏，并且具有高酶活性恢复速率的固定酶可以获得劣质的，即携带者的结合力是在较高的范围内降低了载体和pH的影响。 ier。

3共价结合方法

共价结合是指一种固定方法，该方法将酶的活性非必需侧链组和载体的官能团在共价键的帮助下。

（2）没有实心载体的交联方法

交联方法是指在酶分子之间，酶分子和惰性蛋白之间使用双功能或多功能试剂（多功能试剂（多）试剂（多功能），以使固定的酶与协调键相互差异。

交叉链接方法的优势是，跨链接响应的过程通常是凶猛的，因为酶分子之间可能会发生跨分子之间的互动。不高。

（3）攻击方法

嵌入的方法是将聚合物的单体与酶溶液混合，然后将聚合使用用于聚合剂（包括交叉连接剂），并将酶嵌入聚合物中以实现固定。

嵌入式操作很简单，因为酶分子仅嵌入，化学反应不是化学反应，它可以使高活力固定酶。

1凝胶喂

凝胶嵌入方法是将酶分子埋入多孔凝胶中。

2

嵌入的微型嵌入是指在可渗透的高分子微分微孔膜中包裹一定量的酶 - 溶液。

与凝胶嵌入方法相比，微胶囊方法的优势是：固定的酶颗粒比前者更小，这更有利于底物的扩散和产物，可以随时避免使用较大的体积。它在人体内，也可以被蛋白质水解酶降解，因此它具有更大的医疗价值。

（4）用于不同固定方法的联合

不同的方法具有自己的优势和缺点，在实际的固定操作中，通常使用各种固定方法来获得最佳结果。

3.如何评估固定酶的固定作用。

由于所选固定方法不同，因此固定酶的活力和特性也不同，因此需要评估不同的固定方法。

（1）固定酶的比率

干固定酶的每克（毫克）酶活力单位由单位面积的酶活力单位（CM2）（酶膜，酶管，酶板）表示。

（2）一半的行动

这是测量稳定性的指标。

（3）木偶耦合效率=（添加的蛋白质量 - 溶液中蛋白质残留量）/总蛋白质量添加×100％

（4）活力回收=（固定酶活力/总酶活力）×100％

（5）固定酶活力的比率具有相同的酶蛋白量的相对酶活力与游离酶活力的比率。

（6）固定在负载单位载体中的酶活力（或酶蛋白量）。

4.简要描述固定对酶本质（固定酶的性质）的影响。

（1）稳定性后，稳定性得到增强，并且运行寿命和保存寿命也

延长。

（2）固定酶的最佳温度被固定，大多数酶的热稳定性得到改善，因此最佳温度也得到了改善。

（3）固定酶的动态特征是MI常数km的带电性能随迈克尔常数的力量的变化。

（4）固定酶的特定酶固定后，通常不会改变其特异性。

5.简要描述固定细胞作为生物性剂的优势和缺点。

固定细胞的优点和局限性（问题1（3））

6.设计实验性固定葡萄酒酵母，用于乙醇生产。

7.设计实验以确定固定葡萄糖素酶的活力和活力。

8.固定的木瓜蛋白酶的固定方法在啤酒生产中常用。

9.检查某个交叉连接酶晶体的制备过程和应用。

10.与载体的固定和生化催化剂的固定生化剂的优势相比。

第5章化学酶项目

1.简要描述酶分子化学修饰的基本原理

酶的化学修饰主要是为了改变某些氨基酸侧链，其变化会导致酶蛋白空间和微环境的变化，从而改变酶的特征和功能。

2.修饰酶分子后自然的变化是什么？

首先，重要的是要强调，我们修改酶的目的是改变酶的结构和特征，并在使用方向上改变这种变化。

（1）热稳定性

在大多数情况下，用一些先前引入的一些修饰符修饰酶可以提高酶的稳定性。

（2）抗原性

抗原性是必须在先前引入的修饰符中求解的一个问题，被认为消除酶的抗原修饰剂只是PEG和人类血清蛋白。

（3）对各种类型损失因素的抵抗力

由于表面装饰后将受到保护，因此表面将受到改性剂的保护，因此，在酶装饰后，表面将受到抗蛋白质水解和其他损失因子的能力。

（4）有机体中的一半寿命

因为经过修改，稳定性和与各种损失因素作斗争的能力得到了增强，因此一半寿命通常会延长。

3.可以修改哪些酶分子的侧链？

①可以用碳二敏氨酸，硼氟盐和甲醇来修饰携带者

②可以用酸性赤赤二酸酐，卤素乙酸，芳香族剂和芳香族磺酸来修饰水分

③周期包括形成硫键，有机汞，替代和氧化。

④）

⑤（苯酚）羟基

⑥⑥

吲哚氨

4.为什么循环及其衍生物用作模型模型和大型皇冠模拟酶模型之间的区别是什么？

5.抗体酶催化的反应类型是什么？

①氨基转移

生物体中蛋白质的合成是一个非常复杂的过程。

②恢复反应

餐厅是有机化合物异质性的一种重要形式。

③氧化反应

在生物体中，氧化反应非常宽，主要是呼吸链的一系列反应。

④金属螯合反应

金属螯合反应对辅酶，共酶和酶的组合具有重要意义。

⑤磷酸盐水解反应

运动型键是本质上最稳定的钥匙之一，因此其水解抗体酶是一个挑战。

⑤其他反应

抗体还可以催化反应类型的类型，例如磺酸盐水解反应和光诱导反应。

6.抗体酶的特征是什么？

①可以催化某些天然酶不能催化的反应

抗体的多样性确定抗体酶的催化反应类型的多样性；催化抗体的构建表明，通过免疫学技术，它可以为人工酶的设计和制备打开一种新的和实用的方法。

②具有更强的特异性和稳定性

一种新型的抗体酶的大分子作为酶和抗体的双重功能，用作分子识别成分，其具有可逆分子的突出特性。

③不同的催化机制

酶催化机制是“锁定和键”和“诱导”（ - 拟合）；

7.简要描述分子标记的基本过程

SO称为分子密封件（）是为化合物提供选择性聚合物的聚合物的过程。

①选择密封分子和功能单体，使两者达到互补反应。

②补充痕迹痕迹的单体与其他单体具有聚合反应。

③从聚合物中去除烙印分子。

第6章生物酶项目

1.酶基因的克隆是什么，基本步骤是什么？

引用体外具有自我复制能力的DNA分子与与各种源的体外载体的联系，即重组载体，然后将重组载体引入宿主细胞并培养重组载体，并培养包含目标基因的变压器细胞，然后筛选出筛选的构成量，并获得了大量的基因。

步骤：1）获得目的酶基因

2）选择克隆载体

3）目标基因与载体之间的联系

4）用带目标基因的重组载体转换主机

5）筛选和确定正确的重组

2.酶基因克隆的常见方法是什么？

1）根据已知序列扩展目标基因

2）从遗传文库的已知探针中捕获眼睛的基因

3）未知序列基因的靶标

3.主要生物表达系统的特征是什么？

在原核生物中表达自己的特征：高表达效率，其中大多数选择

大肠杆菌是宿主的表达。

4.真实生物表达系统的特征是什么？

由于缺乏翻译处理系统，在许多情况下，

我们必须采用真实的核细胞表达系统。

母细菌。

细胞和昆虫细胞用作真正的核表达系统。

5.解释酶特异性表达的应用的示例

目前，酶的异质表达已被广泛使用，已应用于工业，农业和

药品，环境和能源以及其他领域。

6.酶分子方向进化的主要方法是什么？

1）错误PCR（容易出错的PCR）

MN2 +可用于替换Mg2 +以在PCR时产生突变。

2）DNA重组（重组）（DNA）