优化细胞培养：培养基和补料策略的关键因素与 DOE 方法

优化细胞培养：培养基和补料策略的关键因素与 DOE 方法

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优化细胞培养中基础培养基和补料培养基的组成以及补料策略是上游工艺开发的关键部分，具有显著提高生产效率的潜力。此外，为了支持高活细胞密度和Qp转化为高表达滴度，培养基的开发和选择还需要考虑一些其他工艺因素。这些工艺因素包括与培养工艺性能、简单性和稳健性、产品质量和表达、与下游工艺的兼容性、法规遵从性以及产品成本相关的因素。细胞培养基和补料的开发非常适合DOE方法，因为其中存在许多相互作用的变量，它们的组合可以带来更高的细胞生产效率，并且DOE可以在这些变量上实现更多的科学研究。

一

国内细胞培养能力

目前，国内大分子生产能力快速增长，带来大量培养基需求。

国内部分企业产能汇总

此外，这些公司的产能还在建设中，预计未来国内产能高峰将达到100万升，这将导致培养基的使用量大幅增加，尤其是行业越来越青睐连续流生产，这将消耗更多的培养基，预计高峰时CHO细胞培养的培养基消耗量将达到2000万升左右。

二

基础培养基

在抗体产品的生产中，使用无血清培养基已成为标准，CD培养基的使用也越来越多。较旧的商业工艺可能仍使用血清或水解物，但新一代CHO培养基不再使用血清和水解物，以避免血清来源引起的外源因子污染风险和水解物引起的批次间差异。有多种市售培养基配方，可在无血清条件下支持抗体生产中使用的宿主细胞系的生长和生产。业界现在专注于设计、开发和销售当今生物制药行业常用的各种CHO细胞系的特定培养基。由于每种培养基对于给定的生产细胞系的表现可能不同，因此通常通过比较几种不同的基础培养基维持细胞生长和生产产品的能力来筛选基础培养基。通常一些商业配方的组合可以提供更高的生产效率。 将候选克隆和基础培养基的筛选整合起来可以变得更加高效，节省大量的工艺开发时间，并实现更高的生产效率和产量。

2.1

能量源

哺乳动物细胞使用葡萄糖和谷氨酰胺作为其首选能量来源。杂交瘤细胞和产生重组抗体的细胞系通常以 1-10 pmol/细胞*天的速率使用葡萄糖。哺乳动物细胞在没有葡萄糖或某些替代糖（如果糖）的情况下不会生长。

通过糖酵解过程，葡萄糖被利用产生乳酸，乳酸在培养初期积累于生物反应器中。虽然乳酸在细胞培养过程的后期可被细胞利用，但过多的乳酸积累会抑制细胞生长和单克隆抗体的产生。乳酸水平可以通过多种方式控制，例如通过控制营养物的添加量，甚至导致乳酸代谢从乳酸净生产转变为乳酸净消耗。乳酸脱氢酶（LDH）可催化丙酮酸转化为乳酸。

有报道指出，在LDH和丙酮酸脱氢酶激酶表达下调的CHO细胞中，乳酸产量下降90%，比生产率提高75%，单位体积抗体产量提高68%，而对细胞生长没有显著影响（但我相信这种方法可能是高度偶然或个别的）。更好地了解低产和高产细胞系的代谢特征和调控机制将有助于开发高产细胞培养工艺。

谷氨酰胺通常与葡萄糖一起使用，以支持细胞生长并帮助维持哺乳动物细胞培养中的细胞活力。杂交瘤细胞利用谷氨酰胺的速率为 1-5 pmol/细胞*天。CHO 细胞对谷氨酰胺的依赖性低于杂交瘤或鼠骨髓瘤细胞，因此可以在培养基中添加较少的谷氨酰胺以维持生长。最近对 CHO 细胞的代谢分析发现，谷氨酰胺在呼吸中的利用效率比葡萄糖更高，并且在指数生长期对乳酸的产生贡献更大。谷氨酰胺代谢产生氨，氨在培养基中积累，抑制细胞生长和产物产生，并可通过抑制糖链末端的唾液酸化来影响单克隆抗体的糖基化。单克隆抗体末端的唾液酸化也受培养基中葡萄糖和谷氨酰胺浓度的影响，低浓度（葡萄糖或谷氨酰胺）会降低产物的唾液酸化水平。 据报道，添加某些氨基酸，如苏氨酸、脯氨酸和甘氨酸，可以降低氨的毒性作用。

葡萄糖和谷氨酰胺的负面影响可以通过适当的喂养策略来最小化，通过控制营养水平和重新引导细胞代谢，可以最大限度地减少乳酸和氨的产生。这种方法被应用于批量培养方法，以增加生物反应器中的细胞数量和单克隆抗体的浓度。

2.2

氨基酸

蛋白质是哺乳动物细胞中最丰富的成分，约占细胞重量的18%。转染细胞产生单克隆抗体时，还需承担合成异源蛋白质的额外负担，这需要大量相应的氨基酸结构单元。

哺乳动物细胞无法合成某些必需氨基酸，必须将这些氨基酸添加到培养基中才能维持细胞生长。

虽然细胞可以合成非必需氨基酸，但它们通常会被添加到培养基配方中。添加这些氨基酸可以减少细胞的能量需求，因为细胞不需要合成氨基酸，多余的能量可以转而用于单克隆抗体的生产。

谷氨酰胺是细胞培养中能量产生、蛋白质和核酸合成所必需的营养元素。然而，在细胞培养基中，谷氨酰胺非常不稳定，会自发降解，产生氨和吡咯烷酮羧酸等副产物。因此，谷氨酰胺通常以二肽的形式提供，二肽要稳定得多。在CHO-GS细胞系的培养基中添加谷氨酰胺和天冬酰胺，可以有效缓冲培养基，减少乳酸的产生，维持较高的细胞活力，提高抗体的生产效率。酪氨酸难溶于水溶液，容易沉淀。如果缺乏这种氨基酸，细胞在表达单克隆抗体时会引入不必要的酪氨酸序列变异，细胞会用另一种氨基酸来代替酪氨酸。添加含有酪氨酸的二肽元素，可以维持培养基中氨基酸的高浓度，从而防止营养限制，减少产品不必要的一级结构变化。 除了营养功能外，苏氨酸、脯氨酸和甘氨酸等几种氨基酸对细胞应激紧急情况（如饥饿、高渗透压、高 CO2 或氨）具有保护作用。这些紧急情况会在批量培养时间过长、高产量或高细胞密度培养中发生。

2.3

酯类

脂质是所有细胞膜的基本结构元素，维持细胞增殖、生长和存活。脂质占哺乳动物细胞重量的 5%。60% 的脂质是磷脂，是细胞膜中最丰富的成分。在整个 CHO 细胞中，三种主要脂质是磷脂（30 fmol/细胞）、胆固醇（10.8 fmol/细胞）和鞘磷脂（1.9 fmol/细胞）。细胞膜含有 49% 的总磷脂、64% 的胆固醇和 69% 的鞘磷脂。从乙醇胺和脂肪酸开始，哺乳动物细胞可以合成磷脂酰乙醇胺，其他磷脂由此衍生。虽然哺乳动物生长需要两种必需脂肪酸，即亚油酸和 α-亚油酸，但这种要求似乎并不适用于哺乳动物细胞培养。 然而，这些脂肪酸以及硫辛酸和某些磷脂（如磷脂酰胆碱）通常包含在基础培养基配方中。一些细胞系无法合成某些脂质，需要将它们包含在培养基中才能生长。一个例子是小鼠骨髓瘤细胞 NS0 对胆固醇的需求，该细胞在胆固醇合成途径中失去了一种酶。用非必需磷脂、脂肪酸和固醇补充细胞培养物可以降低细胞的生物合成要求。哺乳动物细胞对脂质补充的反应不同，但细胞生长和单克隆抗体产生的改善很常见。脂质通常作为分批培养中饲料的一部分添加。如果使用一次性反应器生产单克隆抗体产品，需要考虑的一点是添加的脂质可能会粘附在生物反应器的表面上，细胞难以利用。 为了解决这个问题，在扩大规模之前，需要在小型一次性反应器中研究脂质的补充和利用，并调整补充量以确保细胞有足够的脂质可用。脂质不溶于水，在添加到培养基中时需要分散剂。除了传统的载体血清提取物和牛血清白蛋白外，脂质分散技术还包括乳液、胶束和脂质体。在无血清培养基中，环糊精是一种成功使用的分散剂，它是一种吡喃糖葡萄糖的环状聚合物，可以有效增加脂质的溶解度。环糊精具有双重功能：它们有效地溶解脂质并通过分子封装将它们保持在培养基中。

对于特定的细胞系，需要确定培养基中环糊精的最佳浓度及其与胆固醇脂质的比例，特别是在一次性生物反应器中培养细胞时。等人发现，Wave反应器中培养基中载体甲基-β-环糊精和线性低密度聚乙烯薄膜同时存在就足以抑制胆固醇依赖性NS0细胞的生长。通过减少加入培养基中的过量环糊精，细胞开始使用胆固醇-环糊精复合物作为外源胆固醇的唯一来源。他们提出的生长抑制机制是培养基中过量的环糊精将胆固醇从细胞膜上吸收，然后不可逆地将胆固醇-环糊精复合物吸附或封闭在Wave反应器的线性低密度聚乙烯表面。

2.4

无机离子

哺乳动物细胞对无机离子的需求量不同，可占细胞总重量的1%。这些离子通常在基础培养基中添加足量，在分批培养中一般不会成为限速因素，但在高密度细胞培养中可能成为限速因素。大量文献报道无机离子对抗体的表达率有显著影响。无机离子在培养基中一般以6个相对浓度水平存在：

（1）非常高的浓度（g/L），例如氯化钠，用于调节培养基的渗透压，碳酸氢钠，用于控制培养基的pH值；

（2）高浓度（10-100g/L），包括钙、锂、镁、钾和磷酸盐；

（3）低浓度（约几百毫克/升），包括铁盐、锌盐；

（4）浓度极低（几十毫克/升），如铝、钡、钴、铬、铜、氯化物、硒、钛的盐；

(5) 浓度极低（小于 1 μg/L），例如银、锗、溴、碘、锰、钼、钒、镍和锡的盐。这些无机盐通常作为基础培养基和/或补料培养基的成分添加到培养物中。磷是核酸、磷脂和其他细胞成分的结构成分。有证据表明，在高细胞密度的某些培养物中添加磷酸盐可以增加细胞和单克隆抗体的产生。可以使用柠檬酸盐或 EDTA 以螯合化合物的形式提供铁离子，这可以消除对铁转运蛋白（一种铁转运蛋白）的需求。硒也可用作有效的铁载体，允许在批量和摇瓶培养中实现高密度生长（> 10 x 106 细胞/mL）和高单克隆抗体表达滴度（约 3 g/L）。 在无蛋白培养基中添加锌离子可以完全取代某些杂交瘤细胞（如NS0和CHO细胞）中添加重组胰岛素的需要，并支持良好的细胞生长和单克隆抗体表达。

2.5

维生素

维生素是哺乳动物细胞生长所必需的，大多数培养基配方中都含有足量的维生素。在典型的高密度生长条件下，维生素通常不会限制生长速度。维生素通常作为浓缩饲料添加到培养基中以提高生产率。然而，据报道，维生素浓度超过正常水平的 35% 会限制 CHO 细胞系的生长。

2.6

补充剂

动物血清是研究实验室或生产细胞系开发早期常用的补充剂，但监管和安全问题已大大减少或消除了血清的使用，即使在开发早期阶段也是如此。血清含有营养素、激素、蛋白质和许多其他因子，可直接或间接刺激细胞生长或具有保护作用，使其成为哺乳动物细胞的极佳生长培养基。然而，对于临床和商业生产，使用动物血清存在实际和监管问题，包括血清质量和促进细胞生长的能力的差异性，以及对可能被 BSE 和其他动物病毒污染的担忧。由于这些问题，监管机构已发布旨在控制的监管指导，并实际上阻止了在生物制药生产的所有阶段使用动物血清。

血清可以用多种补充剂代替，例如胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺和硒，这些补充剂最常用于无血清配方。来自动物、酵母或植物的蛋白质水解物也可以用作基础培养基和补充剂的成分。然而，对 BSE 和其他污染病毒的担忧也适用于这些动物来源的水解物和蛋白质，甚至植物来源的水解物也已被证明含有可以在 CHO 细胞或其他细胞中繁殖的动物病毒。因此，目前的趋势是完全化学定义的培养基，虽然从监管和安全角度来看是可以接受的，但对哺乳动物细胞来说，这带来了更具挑战性的生长环境。

鉴于行业在受污染原材料（包括细胞培养基）方面的经验，监管机构已明确要求制定新程序以确保供应链所有组成部分的安全，公司也已开始实施这些程序以降低生产过程中产品污染的风险。这些程序包括修订原材料管理和测试、风险评估、评估可灭活原材料中病毒的技术（如紫外线处理和伽马射线照射），有时还进行核酸检测以进行过程控制。当将胰岛素、转铁蛋白和白蛋白等蛋白质添加到培养基中时，重组来源优于动物来源。使用无蛋白培养基和无蛋白配方可以减少不必要的蛋白质的添加，这些蛋白质可能会影响下游纯化过程，并可能在最终纯化产品中少量存在。许多无血清和无蛋白培养基以粉末或液体形式在市场上有售，包括浓缩物。市售或定制补充剂可提供浓缩营养素和生长因子，用于批量培养过程。

2.7

其他添加剂

据报道，在培养基中添加某些化合物（如丙酸钠和丁酸钠）可提高杂交瘤和 CHO 细胞中的产品产量，尽管其机制尚不完全清楚，但似乎与通过改善基因可及性来增加重链和轻链基因的转录有关。最近，人们添加了 acid 作为转铁蛋白的合成替代品，并发现其在 CHO 细胞中充当胰岛素样生长刺激剂，可用于某些生产过程。研究表明己酸异羟肟酸可使 CHO 细胞中的单克隆抗体产量增加 40%。据报道，戊酸可增加 CHO 细胞培养中的蛋白质产量。丙戊酸 (VPA，2-丙基戊酸) 是一种组蛋白去乙酰化酶的支链羧酸抑制剂。当将其添加到培养基中时，发现在稳定表达单克隆抗体的三个 CHO 细胞系中的两个中，单克隆抗体的表达滴度增加，其中一个是强烈增加，另一个是中等增加。 细胞培养基中通常会添加表面活性剂，例如吐温 80 和 F-68，以保护细胞免受剪切力引起的流体动力学损伤以及生物反应器中搅拌和起泡引起的表面气泡破裂。细胞培养工艺开发涉及测试各种市售或定制的培养基配方，包括部分或全部添加剂以及补料培养基和补料策略，以确定特定生产细胞系的最佳组合。即使是具有共同来源的克隆细胞系在培养基中的表现也可能不同，这主要是因为转基因的未知表观遗传效应或转基因的整合效应。因此，特定工艺开发通常会提供比通常基于亲本细胞系开发的平台工艺更好的工艺。

三

饲料发展战略

采用补料分批培养可防止重要培养基成分的消耗，从而延长细胞培养时间和增加细胞产品的产量。目前，市场上有多种用于 CHO 细胞和其他生产细胞系的补料配方。补料开发包括对废培养基的分析、营养物质（如氨基酸和维生素）的特定消耗率的计算，以及配制浓缩营养培养基，其中每种营养物质对的比例等于其特定消耗率。以这种方式配制培养基的想法是，可以通过补料将消耗的营养物质恢复到其基础水平，从而将所有营养物质恢复到其基础水平。目前，大规模哺乳动物细胞培养的行业实践是使用标准平台的批量培养工艺，定期进行大量固定量补料。最近关于开发补料策略的工作包括自动监控和动态补料，并使用算法来改变补料速率。Lu 等人。 描述一种简单的批量优化策略，其中补料培养基的开发基于对废培养基的分析和补料策略的建立，该策略在离线监测培养基中相关营养成分的浓度后以特定的间隔添加不同体积的补料培养基。