枯草芽胞杆菌的芽胞外衣蛋白 CotA：耐高温、碱性条件的细菌漆酶

枯草芽胞杆菌的芽胞外衣蛋白 CotA：耐高温、碱性条件的细菌漆酶

资助项目：国家自然科学基金（编号）；江南大学工业生物技术教育部重点实验室开放课题（编号）；江苏省高校优势学科建设项目；111人才引进计划（编号111-2-06）；江苏省现代发酵产业协同创新中心项目。

通讯作者：关正兵：电话： -510-； 电子邮件：

摘要：芽孢杆菌漆酶是细菌漆酶的典型代表，耐高温、适应碱性条件，具有很高的工业应用潜力。枯草芽孢杆菌的孢子外壳蛋白CotA是研究最深入的细菌漆酶，其三维结构和催化机理与其他漆酶相似，但其催化位点的结构与其他漆酶有较大区别。同时，近年来还有许多其他类型的芽孢杆菌漆酶被研究者发现。本文从结构特点、催化特点、酶学性质和应用四个方面阐述了芽孢杆菌漆酶的特点及近年来的最新研究进展，并对其前景进行了展望。

关键词：孢子漆酶CotA 染料脱色 木质素降解 生物燃料电池 生物修复

在里面

周文, 关正兵

,蔡玉洁,宋晨萌,廖祥如

中国无锡的钥匙

：pH 值较高。它是具有高pH值的。迄今为止最好的是来自孢子外壳 CotA。多年来，还发现了许多其他类型的。这是，它们的，，和。，的也是。

关键词：孢子

漆酶(EC 1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶，能催化多种酚类化合物的氧化，将分子氧还原为水。它在造纸工业、废水处理、纺织工业、食品加工、生物传感器和生物诊断等领域有着良好的应用前景[]。与真菌漆酶相比，细菌漆酶的氧化还原电位较低，限制了其底物利用范围。但在高温和碱性条件下，细菌漆酶往往更稳定，pH范围更广[]，因此在工业应用中具有更广阔的前景。

1996年van等[]首次发现芽孢杆菌SG-1属的孢子具有类漆酶活性。次年Claus等[]也发现球形芽孢杆菌（ ）的孢子具有类漆酶活性，芽孢杆菌漆酶的研究由此拉开序幕。2001年Hullo等[]证实CotA属于漆酶蛋白，由cotA基因（孢子外壳蛋白）编码，大小约为65kD。此后，在地衣芽孢杆菌（B. ）[]、sp. HR03[]（也产生胞外漆酶，见下文）、短芽孢杆菌（B. ）[]、克劳氏芽孢杆菌（B. ）[]等细菌中也发现了CotA漆酶。 近年来研究人员还发现 (B.)[]、sp. XJT-7、 (B.)[]、 (B.)[]和 (B.)[]的孢子也具有漆酶活性，而sp. HR03[]、sp. ADR[]、. FOR[]、 (B.)[]、sp. SHC1[]和 (B.)[]可产生胞外漆酶， (B.)[]、B. WPI[]、sp. UN2[]可产生胞内漆酶，sp. VUS[]、 (B.)[]、. CS-1和sp. CS-2[]和 (B.)[]均可产生漆酶，但无需提及漆酶的位置。 )[]和 (B. )[].

CotA漆酶是研究最为深入的一类细菌漆酶，研究人员对CotA漆酶的结构、酶学性质等有了深入的了解，近年来在其催化机理、分子生物学方法转化及应用研究等方面也取得了很多新的研究进展。

1 芽孢杆菌漆酶的结构和光谱特征

漆酶属于多铜氧化酶家族，具有多铜氧化酶的共同特点，即含有四个铜离子结合位点[, ]。结构上，对不同漆酶的一级序列进行多次比对，发现其铜结构位点高度保守。植物、真菌和细菌漆酶也具有相似的三维结构（昆虫漆酶尚未见三维结构的报道），但在催化位点上存在明显差异，这与它们的功能多样性和进化关系相一致[, , ]。

1.1 氨基酸序列

2000年，等人[]利用BLAST程序对细菌基因组数据库和蛋白质数据库中真菌漆酶蛋白与细菌漆酶蛋白进行比对，得出结论，许多细菌中可能存在漆酶[]。等人[]将CotA的序列与西葫芦抗坏血酸氧化酶（ZAO）和鬼伞（）漆酶进行了比较，发现它们的相似性较低，分别为36.6%和39.3%，而后两者的相似性为50%。CotA与其他细菌漆酶如大肠杆菌（coli）的CueO、嗜热菌（）和抗生素链霉菌（）的漆酶相似性较低。目前，与CotA漆酶关系最密切的细菌漆酶是紫红链霉菌（S.），二者的相似性为47%[, ]。 芽孢杆菌属漆酶的氨基酸序列也表现出丰富的多样性，芽孢杆菌属的CotA与其他几种CotA的氨基酸序列同一性约为70%[, , ]，而等[]报道的芽孢杆菌属漆酶由lbh1基因编码，分子量为56 kD，与芽孢杆菌属CotA氨基酸序列相似性仅为19%，与 漆酶的相似性也仅为17%（ ）。类似的报道还有很多，例如，B. fmb-1孢子上产生的漆酶分子量为55 kD，而sp. HR03含有能重组表达65 kD蛋白质的cotA基因，能分泌分子量为50 kD的胞外漆酶[, , ]。 非CotA漆酶的分子量各异，甚至B. spp.也能产生分子量为55kD的胞内漆酶[]。总之，芽孢杆菌漆酶的种类很多，有些菌株能同时产生不同类型的漆酶。

1.2 酶蛋白的三维结构

细菌漆酶和真菌漆酶虽然序列同源性较低，但是它们的几何结构相似[]。CotA的折叠结构由三个铜氧化还原样结构域组成。第一个铜氧化还原样结构域（1）以连接结构域1和2的卷曲片段开始，该片段由8股β-桶状（β-）结构组成。这种卷曲片段可能是细菌漆酶所特有的，用于促进这些结构域的组装。第二个铜氧化还原样结构域（2）是结构域1和3之间的桥梁。结构域1和2通过较短的α螺旋片段连接，另外还有一个较大的环片段连接结构域2和3。在CotA和CueO漆酶中，该区域构成结构域2和3之间的外部连接，而在真菌漆酶中，结构域2和3基本由内部连接形成。 第三个铜氧化还原样结构域（3）不仅含有单核铜中心，还参与三核铜中心结合位点的形成。此外，结构域3还含有靠近I型铜中心且位于蛋白质表面的底物结合位点，三核铜中心平面位于结构域1和3之间。此外，由环段和短α螺旋段组成的突起在底物结合位点上形成盖状结构。这种盖状结构可能与底物结合过程有关，是CotA独有的特征[, ]。

1.3 铜中心及光谱特征

CotA具有多铜氧化酶所共有的铜中心结构，其中铜位点根据其光谱特征分为三类，即I型铜（T1，含Cu1）、II型铜（T2，含Cu4）和III型铜（T3，含Cu2和Cu3）。T1由扭曲的双锥三角配位构成，包括两个组氨酸和一个半胱氨酸。第四个位点由该位点的氧化还原电位决定，即CotA中的蛋氨酸[]。若将组氨酸替换，将对漆酶的酶学性质产生明显影响。若将蛋氨酸替换为亮氨酸，虽然不会影响配位结构，甚至可能提高氧化还原电位，但也会引起酶活性的明显下降，甚至检测不到酶活性，不能形成色素[, ]。最新研究表明[]，在单核铜中心附近进行适当的突变，可以降低空间位阻效应，大幅度提高反应速率和酶活性。

和其他真菌漆酶一样，CotA漆酶的T1在600nm处有特定吸收峰，可用电子顺磁共振（EPR）检测到，是典型的蓝色漆酶。T2一端连接两个组氨酸和一个水分子，另一端靠近双核中心，没有特殊的光谱吸收峰。T3有6个组氨酸残基，在330nm处有特定吸收峰，但由于Cu2和Cu3之间存在反铁磁耦合（），导致T3没有EPR信号[, ]。虽然大多数漆酶符合上述规则，但有些漆酶不具备这些典型特征，例如天蓝色链霉菌（S.）的小漆酶（SLAC）仅含有两个结构域，不含有T1[]。芽孢杆菌中也有例外，如来自B. fmb-103[]和sp. ADR[]在600nm处没有吸收峰，后者甚至不能氧化2,2′-连氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)和丁香醛连氮(SGZ)。

2 芽孢杆菌漆酶的催化活性

研究表明[, ]漆酶每个铜中心的作用都是将底物氧化，并将获得的电子转移给分子氧。初始催化循环从T1位点开始，四个氧化的底物分子产生的四个电子通过T1传输到三核铜中心，被三核铜中心平面上的O2结合位点上的分子氧接受，生成两个水分子。氧化后产生的自由基是不稳定的，这些自由基会进一步参与一些非酶促反应并形成产物。氧化产生的自由基还可以扩散到聚合物的易降解位置并与之发生反应，聚合物在进一步的反应中被降解。在此过程中，漆酶首先被还原，转移电子后，又被氧化回初始状态[]（图1）。目前，对芽孢杆菌漆酶的催化机理研究较少。 在以CotA漆酶为模型的研究中发现，它是唯一位于三核铜中心附近的质子活性基团，除了稳定三核铜中心结构外，还与质子通道密切相关，控制氧分子的结合及其进一步还原，对质子化调控、协助质子与T2结合形成羟基也至关重要[, , ]。

图1 漆酶的催化机理

2.1 漆酶对底物的催化作用

漆酶能氧化多种有机和无机底物，包括单酚、二酚、多酚、氨基酚、甲氧基酚、芳香胺和抗坏血酸，生成相应的苯醌和水，并在介质的参与下能与一些非酚类底物发生反应[]。漆酶不能直接氧化底物生成产物，而是催化底物产生不稳定的自由基，这些自由基进一步参与非酶反应生成产物。有自由基参与的非酶反应可产生交联、聚合物降解和芳环断裂三类效应[]。目前为止，尚未发现不同来源的漆酶的非酶反应有差异，但芽孢杆菌漆酶和真菌漆酶的底物范围不同。 据报道[, ]，芽孢杆菌漆酶不能与邻、间、对苯酚反应，也不能与4-氯苯酚和2,4-二氯苯酚反应。邻位无甲氧基的底物（如香豆酸和肉桂酸）不能被氧化，而这些底物在真菌漆酶中可以被氧化。实验证实，苯酚邻位带有甲氧基的底物更容易被氧化，并且底物脂肪链的长度可能比邻位有无甲氧基对底物氧化的影响更大。2011年，Reiss等[]研究了CotA漆酶对37种潜在底物的催化活性，结果进一步证实CotA漆酶优先氧化至少一个邻位或对位取代基带有孤对电子的取代苯酚。

2.2 氧化还原电位

T1位铜位是底物氧化的限速位，铜离子在单价和二价状态之间切换[]。漆酶要从底物上获取电子，这些底物的氧化还原电位只能低于或略高于T1。CotA相对于真核漆酶的最大劣势就是其氧化还原电位较低（CotA约为455 mV，而真菌漆酶约为780 mV[]），这可能是CotA漆酶的底物光谱与真菌漆酶不同的重要原因，大大降低了CotA漆酶的应用范围。影响氧化还原电位的因素很多，包括溶剂亲和力、氢键、轴向配体的类型、偶极取向以及配体与铜原子之间的距离等。 Hong 等[]对CotA、CueO、SLAC以及真菌漆酶（来源于T. ）等4种漆酶进行了比较分析，发现T1周围高度保守的配体His(Nδ)-Cys(S)-His(Nδ)对氧化还原电位影响不大，而轴向氨基酸的性质则强烈影响漆酶的氧化还原电位。他们还发现多铜氧化酶的主链偶极子（ ）可以提高氧化还原电位，而侧链和溶剂偶极子（ ）则可降低氧化还原电位。Mot等[]对大量漆酶的氨基酸序列进行了分析，发现当轴向配体为苯丙氨酸、亮氨酸和蛋氨酸时，它们的氧化还原电位分别为高、中、低。除了T1配位层外，氧化还原电位还会根据蛋白质、底物和pH条件而变化。

通过分子改造获得具有高氧化还原电位的芽孢杆菌漆酶是一项有价值但具有挑战性的工作。Durao等[]利用X射线将位点分别突变为苯丙氨酸和亮氨酸，氧化还原电位分别提高了约60 mV和90 mV，但突变体M502L在不同底物下Kcat降低了2~4倍，M502F的Kcat下降更为严重。后来他们[]将和替换为丙氨酸，但氧化还原电位和Kcat均大大降低。其他一些研究小组也报道对CotA漆酶的氧化还原电位改造并不有效[,,]。2009年，等[]尝试通过定向进化来提高CotA漆酶的氧化还原电位。 他们建立了CotA漆酶的定向进化表达系统，进而利用高通量筛选（HTS）技术筛选出能够氧化高氧化还原电位染料的漆酶，但目前还未见获得高氧化还原电位的CotA漆酶的报道。

3 芽孢杆菌漆酶的酶学性质

芽孢杆菌漆酶首次发现时，因其最适温度高、热稳定性强、pH范围宽等特点而受到广泛关注。一般来说，蛋白质的耐热性由盐桥、氢键、α螺旋构象等物理化学结构因素决定，但漆酶也有其自身的特点：真菌漆酶的糖基化修饰常可提高其耐热性，而CotA由于三个结构域间存在大量疏水相互作用、脯氨酸浓度高、蛋白质包装紧密等原因，具有较好的耐热性，但二硫键对CotA的耐热性没有影响[, ]。孢子本身具有耐热、耐旱、耐辐射、耐药等特点，在pH、温度、抑制剂、有机溶剂、金属离子等因素对孢子漆酶的影响中，孢子本身的特殊结构也可能起到一定的作用。

3.1 最适pH和pH稳定性

大量研究表明，以ABTS为底物时，芽孢杆菌漆酶的最适pH一般在4.0～5.0之间；以SGZ和2，6-二甲氧基苯酚（2，6-，DMP）为底物时，最适pH分别分布在6.5～7.5和6.0～8.6之间（表1）。其最适pH范围受底物影响的特点与真菌漆酶相似，但真菌漆酶更适应酸性条件。以ABTS、SGZ和DMP为底物，真菌漆酶的最适pH主要分别分布在2.0～4.0、3.5～6.5和3.0～6.2之间[]。其它细菌漆酶在碱性条件下也有较高的酶活性。芽孢杆菌漆酶的pH稳定性很好。 在pH为3.0的环境中贮存1天后，残留酶活通常在20%～50%之间，甚至有特殊情况贮存10天后酶活仍在100%以上。在碱性条件下贮存时间更长（表1）。相比之下，一些真菌漆酶只能在中性或酸性条件下有较高的pH稳定性。可以看出，芽孢杆菌漆酶在很宽的pH范围内都有很好的稳定性[]。本实验室前期筛选出一株具有高漆酶活力的短小芽孢杆菌菌株W3。酶学性质分析表明，该菌株CotA漆酶以DMP为底物的最适pH为7.8，pH稳定范围为3.0～10.0，温度稳定范围为20～90℃； 在50 ℃、pH 9.0条件下保温10 d后,残留酶活力仍在95%左右,且能耐受一定浓度的各种有机溶剂和NaCl,表明CotA漆酶在印染废水脱色处理中具有很大的应用潜力[。

值得注意的是，芽孢杆菌产生的胞外漆酶以及其他不依赖芽孢的漆酶的耐碱性相对较弱（表1），但还需要进一步研究。

表1 不同芽孢杆菌属漆酶的酶学性质

漆酶源

漆酶形式

最佳温度（℃）

最佳pH值

热稳定性半衰期[t1/2(h)]/T(°C)半衰期(t1/2(h))/T(°C)

pH稳定性残留酶活性[pH，t（d）]pH-（pH，t（d））

ABTS

新加坡证券

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pH 值 3.0

pH ≥ 8.0

B.MB24[]

斯拉卡

75

1.87/80

淋巴细胞

75

3.73/80

B.WD23[]

乳酸菌

60

6.8

2.50/80

50%（9,15）

70

6.8

乳酸杆菌

四十五

7.2

0.50/80

B.WN02[]

乳酸菌

60

3.0

7.0

8.6

20%（3.1）

≥100% (10,10)

B.X1[]

乳酸杆菌

60

4.4

6.9

7.4

2.50/80

23%（3.1）

163%（9,10）

168[]

乳酸杆菌

4.0

6.5

7.0

0.83/80

B.DSM 13[]

乳酸杆菌

85

4.2

7.0

7.0

B.LS04[, ]

乳酸菌

60

4.4

6.6

7.4

20%（3.1）

102%（9,10）

乳酸杆菌

70

4.2

6.2

6.6

1.20/80

23%（3.1）

B.DSM 27[]

乳酸杆菌

70

4.0

6.5

7.0

3.50/65

B. W3[]

乳酸杆菌

80

4.6

7.2

7.8

6.50/80

21%（3.1）

169%（9,10）

B.LC03[]

乳酸菌

60

3.8

6.8

>4.00/70

20%（3.1）

≥80%（9,10）

B.LS05[]

乳酸菌

70

3.0

6.6

4.00/60

50%（3.1）

80%（9,10）

B. 12B[]

乳酸菌

80

4.0

乳酸杆菌

80

4.5

B. []

乳酸菌

60

6.0

B.fmb-103[, ]

乳酸菌

85

4.4

7.4

5.00/80

100％（3,10）

38%（9,10）

82

4.8

7.4

4.00/80

40%（3.10）

85%（9,10）

sp. HR03[, ]

蕾丝

55

5.5

5.5

乳酸杆菌

4.0

7.0

7.4

0.75/80

sp. ADR[]

埃拉克

40

4.0

适用于[]

埃拉克

三十五

3.0

0.38/75

B.SN4[]

埃拉克

85

5.5

6.0

8.0

3.00/80

75% (9,1)

KSM-16[]

乳酸杆菌

4.0

7.0

8.0

0.33/80

科幻[]

磷脂

0.08/60

50%（8.5,2）

乳酸菌

66.00/60

伊斯拉克

（66.00−80.00）/60

注：a：孢子漆酶；b：重组漆酶；c：固定化孢子漆酶；d：从孢子中纯化的漆酶；e：胞外漆酶（非重组）。

注：a：孢子；b：；c：孢子；d：来自；e：（非）。

3.2 最佳温度和温度稳定性

近年来，多项研究表明，孢子漆酶的最适温度主要集中在60～80 ℃（表1）。据王春雷[]研究，B.WD23来源的漆酶随重组表达、孢子和固定化3种形式最适温度依次升高，分别为45、60和70 ℃，3种形式漆酶的稳定性也依次升高。从孢子中纯化的漆酶稳定性比孢子漆酶差，最适温度也较低，如SF孢子漆酶纯化后在60 ℃下的半衰期仅为5 min，而天然孢子漆酶的半衰期可达66 h，固定化孢子漆酶的半衰期甚至更高[]。从孢子中纯化的漆酶稳定性差可能是由于纯化过程中蛋白质和（或）多糖的损失所致[]。 也有较多报道重组漆酶具有更好的热稳定性（表1），例如来自B. 12B的重组漆酶的热稳定性明显强于孢子漆酶，即使在100 ℃下，重组漆酶仍保持90%左右的活性，而孢子漆酶的活性仅保持45%左右。重组漆酶稳定性强于孢子漆酶的现象可能是由于孢子蛋白层变性，导致坍塌，抑制了漆酶与底物的接触[]。令人惊讶的是，Abari等[]报道一种海洋细菌XJT-7 sp.的漆酶活性在高温失活后比失活前更高，但原因尚不清楚。不依赖孢子的芽孢杆菌漆酶的稳定性也很特殊，例如sp. 分泌的胞外漆酶的最适温度为100 ℃。 ADR为40 ℃，50 ℃孵育1 h后酶活性完全消失[]。此外，对酶分子进行适当的修饰可以提高热稳定性，例如et al.[]研究发现CotA表面的环状片段与CotA漆酶的热稳定性有关，将环状片段突变为赖氨酸后，酶在高温条件下的热稳定性和酶活性大大提高。

真菌漆酶的最适温度大多集中在50～70 ℃，在50 ℃下的半衰期为2～70 h。真菌漆酶在60 ℃以上活性会迅速下降，耐热性不强[。但也有一些例外，如来自鳞状卟啉单胞菌（ ）的漆酶在60 ℃下的半衰期为8 d，来自朱红色卟啉单胞菌（ ）的漆酶在80 ℃下的半衰期为2 h[。

3.3 抑制剂对酶的影响

芽孢杆菌漆酶抑制剂的研究主要集中在SDS、EDTA、L-半胱氨酸、叠氮化钠、二硫苏糖醇（DTT）、巯基乙醇、氯化钠等试剂上，其中L-半胱氨酸、DTT、叠氮化钠对漆酶的抑制效果非常明显，在0.1mmol/L浓度下就能抑制漆酶。

约90%的酶活。巯基乙醇的抑制作用也很明显，当其浓度达到2.5 mmol/L时，可使酶抑制100%。相对而言，SDS、EDTA、氯化钠的抑制作用不明显，当它们的浓度分别超过0.1、25、100 mmol/L左右时，漆酶逐渐受到较大的抑制[，，，，，，]。但不同来源的漆酶对抑制剂的耐受性差异很大，重组表达后，漆酶抵抗抑制的能力也可能发生变化，例如根据Lu等[]的研究，在1.0 mmol/L SDS作用下，孢子漆酶被抑制30%，而重组漆酶的酶活却升至约114%。

3.4 有机溶剂对酶的影响

许多有机化合物难溶或不溶于水，而向水中加入适量的有机溶剂往往可以增加有机化合物的溶解度，使酶促反应顺利进行。此时有机溶剂对酶的作用就至关重要。过高浓度的有机溶剂通常会导致酶失活。这是因为有机溶剂存在时，活性位点的水分子可能会被取代。同时，有机溶剂也可能导致溶液的pH值发生变化。疏水作用和三维结构的变形也会使酶失活[]。

目前，已有不少研究者对有机溶剂对芽孢杆菌漆酶的影响进行了研究和探索。据报道，甲醇、乙醇、丙酮、乙腈和二甲基亚砜（DMSO）在10%和20%浓度下均能促进酶活性，前三者在10%浓度时酶活性甚至可以提高到142%；当浓度达到50%时，所有的有机溶剂都会对芽孢杆菌漆酶产生抑制作用[, , ]。与其他酶学性质一样，重组漆酶与野生型漆酶的稳定性有时也会有很大差别，例如在50%二甲苯溶液中，芽孢杆菌漆酶的酶活性尚有初始的94.28%，而重组CotA漆酶的酶活性已剩下不到15%[, ]。适当的碱基突变也可以提高漆酶在有机溶剂中的稳定性。 例如，et al.[]将蛋白质表面带负电荷的氨基酸替换为疏水残基，以增加热稳定性和有机溶剂稳定性。他们还发现酶的稳定性取决于烷基链的长度，漆酶的有机溶剂耐受性与热稳定性呈正相关。

关于真菌漆酶的研究有很多报道，指出漆酶固定化大大提高了其对有机溶剂的耐受性，即使在有机溶剂浓度为93%的混合溶剂中，漆酶的酶活仍有10%−20%[]。目前，对芽孢杆菌漆酶固定化的研究较少，尚未有人探究其固定化后在有机溶剂中的稳定性。

3.5 金属离子对酶的影响

研究表明，不同的金属离子对芽孢杆菌漆酶的影响不同，在10 mmol/L浓度范围内，Li+、Na+、Mg2+、Ca2+、Ba2+对芽孢杆菌漆酶均有促进作用，且Mg2+、Ca2+、Ba2+的作用尤为明显；K+对酶活性的促进作用较小，Ag+和Hg2+则严重抑制漆酶活性，Fe3+也有较小的抑制作用；Mn2+和Zn2+对芽孢杆菌漆酶活性的影响目前还很难确定，有报道既有很大的促进作用，也有很强的抑制作用，这可能与漆酶的来源和处理方法有关[，，，，，]。

金属离子中，对漆酶影响最大的是铜离子。铜离子是CotA漆酶的必需成分，对漆酶的活性影响很大。在缺乏铜的情况下，CotA仍会组装到芽孢杆菌外壳中，但酶不活跃，而铜过量时酶活性受到抑制[]。三核铜中心含铜位点的正确折叠与铜密不可分，这可以部分解释酶的动力学和稳定性特性的差异。培养基中的氧含量对大肠杆菌重组表达的CotA的铜含量有很大影响，在有氧环境下，大肠杆菌会表达大量缺铜的CotA蛋白。相反，在铜充足的微氧生长环境中，缺铜的蛋白质相对较少[]。同时，CotA中的二硫键也影响催化中心铜的掺入和释放。 当二硫键被去除后，铜的掺入和释放速度更快[]。此外，Gunne等[]发现有一种铜伴侣蛋白也能影响铜离子插入CotA，这种蛋白在大肠杆菌中是没有的。他们在大肠杆菌中共表达了CotA和来自芽孢杆菌的铜伴侣CopZ，铜占据率提高了20%，活性提高了26%，为芽孢杆菌漆酶的异源表达提供了新的理论。

4 芽孢杆菌漆酶的应用

漆酶具有氧化单酚、二酚、多酚、氨基酚、甲氧基酚、芳香胺和抗坏血酸的能力，一直是环保、造纸、纺织，甚至食品工业、能源、医疗等行业的研究热点[]。目前，芽孢杆菌漆酶的应用研究主要集中在以下几个方面。

4.1 染料脱色

合成染料以纺织厂、染料制造厂废水的形式排入环境。利用漆酶对合成染料进行脱色，为解决染料的环境污染问题提供了新方法。目前，白腐真菌漆酶是降解各种染料最有效的漆酶[]。然而，白腐真菌漆酶极其依赖酸性条件，当环境pH高于7.0时，没有脱色效果。相比之下，孢子漆酶在碱性条件下活性更高，即使在pH为9.0时也能完成脱色过程[]。

目前，有关于五种染料的脱色的报告，包括偶氮染料，三甲烷染料，蒽醌染料，苯甲酸染料染料和靛蓝染料，而最常见的是染料的染料。染料的芳族环上的芳香环[]是由于不同菌株的脱色效率的不同。 反应B. LS04的反应性黑色5，反应性蓝色19和靛蓝的盐分均超过1小时，而跨B. lc02的孢子腔的脱色率却相同。三甲烷染料反复使用5次。固定的LC02的孢子漆仍然可以在pH 9.0的溶液中反复使用15次后达到99％的脱色效率。

废水的组成通常是复杂的，例如，多种酶是一种常见的方法，例如，kadam等人。 []还发现，来自 （）的二氧化糖酶比Cota漆酶更特异性，但是当最终产物的毒性比原始染料高2-3倍，当它们在含有硫糖酶的废水中添加了Cota漆。染料废水超过80％，排毒水平增加到50％。 在我们的实验室中重组表达的 cota漆酶在暴露于碱性条件下（pH 9.0）后，可以实现氧化脱色率超过90％，而两个蒽醌染料可实现5 h []。

4.2木质素降解

木质素是地球上最丰富的聚合物。过氧化物酶和锰过氧化物酶[]。

对木质素降解的研究相对较晚。以协同的方式降低了彩色小组，而cota-比混合使用两个父级的酚类化合物的效率高2.3倍。 ix。 木聚糖酶可以降解Xylan并暴露更多的木质素，这有利于漆酶或Abts自由基的攻击，因此酚类化合物是根据纸浆纤维从相同的原理中释放出来的。催化效率可以提高，从而使糖酶残基还原糖，Chang等人的表达可以大大增加植物酸的植物酸，同时使用SP脱脂蛋白。

4.3生物燃料电池

酶生物燃料电池（EBFC）是一种新兴的技术，它使用生物催化剂（酶）而不是传统的金属催化剂来产生电流，从而氧化燃料的阳极并减少氧化剂的氧化，从而使氧气直接减少氧气，从而使氧化物逐渐渗透到一般地中，以使其在一个互动中逐个转移。生物燃料细胞[]漆生物均具有良好的稳定性，并在2011年使用它作为一个有吸引力的研究。 O2，这些COTA修饰的电极的催化性能比T. spp的轻度漆酶更好。 COTA漆皮电极的最佳工作温度为45-50°C，其电流仍具有初始电流的35％，并保持稳定的电流，该电流具有比真菌漆的更好的应用。无葡萄糖/O2微流体生物库，而原始的COTA仍用作阴极催化剂。

4.4其他潜在应用

除上述应用外，还可以用于生物修复，有机合成，生物传感器，生物燃料，医学诊断和药物保健[，]，其中一些是在细菌中开发的。进行自我偶联，以合成可用于染发的新染料，并处理的芳香胺会导致二聚体合成苯胺（）和苯氧嗪酮（）在中的苯丙胺酮（）。比真菌漆壳。 用橄榄油工厂的废水污染的芽孢杆菌在生物化中污染了橄榄油厂和有机物（BMDS）的独特优势[，]。与整个漆酶的应用相比，盟友友好，并且具有巨大的工业应用。

5前景

长期以来，真菌漆是唯一在2011年真正应用的漆IAL漆酶由于其高温耐药性，碱性耐药性，丰富的资源以及在工业寄主生物的易于表达而引起了广泛的关注。

目前，COTA的结构基本上是清晰的，并且还对芽孢杆菌的性质进行了更加清晰的研究，但是与实际工业化相关的距离仍有距离。 ，酶用于提高酶的重复利用率并改善酶的稳定性。

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